1- گروه علوم درمانگاهی، واحد سنندج، دانشگاه آزاد اسلامی، سنندج، ایران
2- گروه بیماری های داخلی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3- گروه کلینیکال پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
2- گروه بیماری های داخلی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3- گروه کلینیکال پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران
چکیده: (910 مشاهده)
چکیده مبسوط
مقدمه و هدف: بیماری لپتوسپیروز که توسط سروتیپهای باکتری لپتوسپیرا اینتروگانس ایجاد میشود، یکی از خطرناکترین بیماریهای زئونوز بهشمار میرود که طیف وسیعی از نشانه های بالینی تحت حاد تا حاد را ایجاد میکند، میتواند سبب ناباروری، سقط جنین و کاهش تولید شود و خسارات اقتصادی زیادی به صنعت دامپروری کشور وارد نماید. تشخیص بیماری لپتوسپیروز، به دلیل مخاطرات بالقوه ی آن برای جوامع بشری، از اهمیت ویژه ای برخوردار است، زیرا این بیماری به راحتی توسط میزبانانی نظیر موش و سگ که در اغلب موارد به تعداد قابل توجهی در محیط های نگهداری دام ها پیدا می شوند، انتقال می یابد. اما از آن جایی که این بیماری قادر است علائمی بسیار گمراه کننده مانند زردی مخاطات، تورم غدد لنفاوی، التهاب عنبیه، خون شاش، ورم پستان، افت شدید تولید شیر و تغییر رنگ آن، سقط جنین، تولد گوساله های ضعیف، کاهش وزن و اختلال در باروری را در دام ها ایجاد کند، احتمال افزایش خطا در تشخیص بیماری را از سوی دامپزشکان مهیا می کند و به این ترتیب وضعیت سلامت جوامع انسانی را تحت تأثیر قرار می دهد. برای تشخیص آزمایشگاهی بیماری از روش های مختلفی مانند مشاهده مستقیم میکروسکوپی، کشت،PCR ، آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپی(MAT) ، روش الیزا (ELISA) و ایمونوفلورسانس (IFA) می توان استفاده نمود. هدف از این تحقیق مطالعه بررسی سه روش سرولوژی، کشت و PCR در تشخیص لپتوسپیروز گاوها بود.
مواد و روش ها: در این مطالعه از 400 راس گاو که حداقل سابقه یکی از علائم لپتوسپیروز را داشتند، نمونه های خون و ادرار برداشت شدند. خونگیری از ورید وداج تحت شرایط بهداشتی انجام گرفت. از نمونه سرم خون برای آزمایش سرولوژی (MAT) استفاده شد. جداسازی سرم ها از لوله های حاوی لخته ی خون با قراردادن آنها در بنماری °C37 به مدت 20 دقیقه، و سانتریفیوژ با سرعت g ×3000 و به مدت 10 دقیقه انجام شد. به منظور حفظ سرم های جدا شده تا زمان شروع آزمایش MAT، سرم ها توسط سمپلر به میکروتیوب های استریل 2 میلی لیتری انتقال داده شدند تا در دمای °C20- نگهداری شوند. برای انجام روش تست استاندارد MAT، آنتی ژن مورد استفاده در این روش (لپتوسپیرا اینتروگانس) به مدت 7 الی 10روز در یک محیط کشت مایع کشت داده شد. میزان حجم لپتوسپیرای مورد استفاده توسط شمارش اتاقک ها مورد ارزیابی قرار گرفت و این حجم به نحوی تنظیم شد که در هر میلی لیتر، 108×2 لپتوسپیرا وجود داشته باشد. از نمونه های ادرار برای کشت ادرار و آزمایش PCR استفاده گردید. برای انجام آزمایش PCR، پرایمرهای باکتری لپتوسپیرا اینتروگانس مورد بررسی قرارگرفتند. گسترش واکنش های PCR در حجم های واکنش 25 میکرولیتری با استفاده از مسترمیکس آماده (شرکت BIOFACT، کره، ddH2O: 5.50 µL, Buffer: 12.50 µL, Forward primer: 1.00 µL, Reverse primer: 1.00 µL, DNA: 5.00 µL) انجام گرفت. حجم ادرار مورد نیاز 50 میلی لیتر بود که این حجم در بطری های حاوی 0/5 میلی لیتر فرمالدئید فیلترشده (μm 0/45) جمع آوری گردید. سپس به منظور انجام کشت و جداسازی باکتری لپتوسپیرا، 5 میکرولیتر از ادرار جمع آوری در محیط کشت اختصاصی باکتری (محیط کشت نیمه جامد EMJH) تلقیح شد. محیط های کشت حداقل به مدت 5 هفته در درمای °C30 انکوبه گردیدند و هر یک هفته در میان برای بررسی رشد لپتوسپیرا با استفاده از میکروسکوپ زمینه سیاه (DFM) مورد بررسی قرار گرفتند. دادهها با استفاده از آزمون کایاسکوئر و آزمون دقیق فیشر با استفاده از نرمافزار آماری (SPSS 23.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA 2007) تجزیه و تحلیل شدند. تفاوتهای معنیدار بین میانگینها در سطح معنیداری 0/05 > P در نظر گرفته شدند.
یافته ها: تست MAT در پنج راس گاو (1/2 درصد) مثبت بود. سروتیپ های ایکتروهموراژیه (2 راس= 40 درصد)، گریپوتیفوزا (2 راس=40 درصد) و کانیکولا (1 راس=20 درصد) شایع ترین بودند. هر پنج نمونه ای که تست MAT آنها مثبت اعلام شد، به علاوه تمام گاوهایی که علائم بالینی لپتوسپیرووز را داشتند کاندید انجام آزمایش PCR شدند که در این میان، نتیجه چهار راس گاو (1 درصد) مثبت شد. برای تمامی گاوهای مشکوک که تست MAT، PCR و علائم بالینی مثبت داشتند، از نمونه های ادرار، کشت تهیه شد. علی رغم آلودگی دو نمونه از محیط کشت ها به باکتری های محیطی، هیچ یک از دیگر محیط ها آلودگی نشان ندادند و رشد لپتوسپیرا در محیط ملاحظه نشد (صفر درصد). از آن جایی که حیواناتی که در مراحل اولیه بیماری هستند و سیستم ایمنی بدن آنها هنوز باکتری ها را از خون به طور کامل پاک نکرده است، باکتری ها ممکن است زمان کافی برای کلونیزاسیون در کلیه پیدا نکرده باشند و این منجر به نمونه ادرار منفی شده است. همچنین، باکتری لپتوسپیرا به بسیاری از آنتی بیوتیک ها حساس است (درمان آن داکسی سایکلین و آزیترومایسین است)، لذا در مواردی که دام بیماری دیگری دارد ممکن است این آنتی بیوتیک ها استفاده گردد، در نتیجه باعث از بین رفتن باکتری و منفی شدن کشت گردد.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان دادند که شیوع آلودگی لپتوسپیرا در گاوهای استان مرکزی بسیار کمتر از دیگر مطالعات بود که به همین دلیل امکان مقایسه دقیق سه روش باهم امکان پذیر نبود، نکته جالب در این مطالعه، عدم همپوشانی تست های مثبت در دو روش MAT و PCR بود که به نظر می رسد مطالعات بیشتری برای مقایسه دقیقتر این دو روش ضروری است. با توجه به نتایج این پژوهش، روش کشت ادرار به دلیل طولانی بودن فرآیند آن و شرایط خاص کلونیزاسیون باکتری توصیه نمی گردد.
مقدمه و هدف: بیماری لپتوسپیروز که توسط سروتیپهای باکتری لپتوسپیرا اینتروگانس ایجاد میشود، یکی از خطرناکترین بیماریهای زئونوز بهشمار میرود که طیف وسیعی از نشانه های بالینی تحت حاد تا حاد را ایجاد میکند، میتواند سبب ناباروری، سقط جنین و کاهش تولید شود و خسارات اقتصادی زیادی به صنعت دامپروری کشور وارد نماید. تشخیص بیماری لپتوسپیروز، به دلیل مخاطرات بالقوه ی آن برای جوامع بشری، از اهمیت ویژه ای برخوردار است، زیرا این بیماری به راحتی توسط میزبانانی نظیر موش و سگ که در اغلب موارد به تعداد قابل توجهی در محیط های نگهداری دام ها پیدا می شوند، انتقال می یابد. اما از آن جایی که این بیماری قادر است علائمی بسیار گمراه کننده مانند زردی مخاطات، تورم غدد لنفاوی، التهاب عنبیه، خون شاش، ورم پستان، افت شدید تولید شیر و تغییر رنگ آن، سقط جنین، تولد گوساله های ضعیف، کاهش وزن و اختلال در باروری را در دام ها ایجاد کند، احتمال افزایش خطا در تشخیص بیماری را از سوی دامپزشکان مهیا می کند و به این ترتیب وضعیت سلامت جوامع انسانی را تحت تأثیر قرار می دهد. برای تشخیص آزمایشگاهی بیماری از روش های مختلفی مانند مشاهده مستقیم میکروسکوپی، کشت،PCR ، آزمایش آگلوتیناسیون میکروسکوپی(MAT) ، روش الیزا (ELISA) و ایمونوفلورسانس (IFA) می توان استفاده نمود. هدف از این تحقیق مطالعه بررسی سه روش سرولوژی، کشت و PCR در تشخیص لپتوسپیروز گاوها بود.
مواد و روش ها: در این مطالعه از 400 راس گاو که حداقل سابقه یکی از علائم لپتوسپیروز را داشتند، نمونه های خون و ادرار برداشت شدند. خونگیری از ورید وداج تحت شرایط بهداشتی انجام گرفت. از نمونه سرم خون برای آزمایش سرولوژی (MAT) استفاده شد. جداسازی سرم ها از لوله های حاوی لخته ی خون با قراردادن آنها در بنماری °C37 به مدت 20 دقیقه، و سانتریفیوژ با سرعت g ×3000 و به مدت 10 دقیقه انجام شد. به منظور حفظ سرم های جدا شده تا زمان شروع آزمایش MAT، سرم ها توسط سمپلر به میکروتیوب های استریل 2 میلی لیتری انتقال داده شدند تا در دمای °C20- نگهداری شوند. برای انجام روش تست استاندارد MAT، آنتی ژن مورد استفاده در این روش (لپتوسپیرا اینتروگانس) به مدت 7 الی 10روز در یک محیط کشت مایع کشت داده شد. میزان حجم لپتوسپیرای مورد استفاده توسط شمارش اتاقک ها مورد ارزیابی قرار گرفت و این حجم به نحوی تنظیم شد که در هر میلی لیتر، 108×2 لپتوسپیرا وجود داشته باشد. از نمونه های ادرار برای کشت ادرار و آزمایش PCR استفاده گردید. برای انجام آزمایش PCR، پرایمرهای باکتری لپتوسپیرا اینتروگانس مورد بررسی قرارگرفتند. گسترش واکنش های PCR در حجم های واکنش 25 میکرولیتری با استفاده از مسترمیکس آماده (شرکت BIOFACT، کره، ddH2O: 5.50 µL, Buffer: 12.50 µL, Forward primer: 1.00 µL, Reverse primer: 1.00 µL, DNA: 5.00 µL) انجام گرفت. حجم ادرار مورد نیاز 50 میلی لیتر بود که این حجم در بطری های حاوی 0/5 میلی لیتر فرمالدئید فیلترشده (μm 0/45) جمع آوری گردید. سپس به منظور انجام کشت و جداسازی باکتری لپتوسپیرا، 5 میکرولیتر از ادرار جمع آوری در محیط کشت اختصاصی باکتری (محیط کشت نیمه جامد EMJH) تلقیح شد. محیط های کشت حداقل به مدت 5 هفته در درمای °C30 انکوبه گردیدند و هر یک هفته در میان برای بررسی رشد لپتوسپیرا با استفاده از میکروسکوپ زمینه سیاه (DFM) مورد بررسی قرار گرفتند. دادهها با استفاده از آزمون کایاسکوئر و آزمون دقیق فیشر با استفاده از نرمافزار آماری (SPSS 23.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA 2007) تجزیه و تحلیل شدند. تفاوتهای معنیدار بین میانگینها در سطح معنیداری 0/05 > P در نظر گرفته شدند.
یافته ها: تست MAT در پنج راس گاو (1/2 درصد) مثبت بود. سروتیپ های ایکتروهموراژیه (2 راس= 40 درصد)، گریپوتیفوزا (2 راس=40 درصد) و کانیکولا (1 راس=20 درصد) شایع ترین بودند. هر پنج نمونه ای که تست MAT آنها مثبت اعلام شد، به علاوه تمام گاوهایی که علائم بالینی لپتوسپیرووز را داشتند کاندید انجام آزمایش PCR شدند که در این میان، نتیجه چهار راس گاو (1 درصد) مثبت شد. برای تمامی گاوهای مشکوک که تست MAT، PCR و علائم بالینی مثبت داشتند، از نمونه های ادرار، کشت تهیه شد. علی رغم آلودگی دو نمونه از محیط کشت ها به باکتری های محیطی، هیچ یک از دیگر محیط ها آلودگی نشان ندادند و رشد لپتوسپیرا در محیط ملاحظه نشد (صفر درصد). از آن جایی که حیواناتی که در مراحل اولیه بیماری هستند و سیستم ایمنی بدن آنها هنوز باکتری ها را از خون به طور کامل پاک نکرده است، باکتری ها ممکن است زمان کافی برای کلونیزاسیون در کلیه پیدا نکرده باشند و این منجر به نمونه ادرار منفی شده است. همچنین، باکتری لپتوسپیرا به بسیاری از آنتی بیوتیک ها حساس است (درمان آن داکسی سایکلین و آزیترومایسین است)، لذا در مواردی که دام بیماری دیگری دارد ممکن است این آنتی بیوتیک ها استفاده گردد، در نتیجه باعث از بین رفتن باکتری و منفی شدن کشت گردد.
نتیجه گیری: نتایج این پژوهش نشان دادند که شیوع آلودگی لپتوسپیرا در گاوهای استان مرکزی بسیار کمتر از دیگر مطالعات بود که به همین دلیل امکان مقایسه دقیق سه روش باهم امکان پذیر نبود، نکته جالب در این مطالعه، عدم همپوشانی تست های مثبت در دو روش MAT و PCR بود که به نظر می رسد مطالعات بیشتری برای مقایسه دقیقتر این دو روش ضروری است. با توجه به نتایج این پژوهش، روش کشت ادرار به دلیل طولانی بودن فرآیند آن و شرایط خاص کلونیزاسیون باکتری توصیه نمی گردد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
