تابستان
برگشت به فهرست مقالات |
برگشت به فهرست نسخه ها
1- دانشگاه آزاد اسلامی،
2- سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی
2- سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی
چکیده: (252 مشاهده)
مقدمه و هدف: باکتری کلستریدیوم نووئی نوع B عامل بیماری قانقاریای عفونی کبد (Black disease) در گوسفند و بز است. این باکتری سم سلولی به نام آلفا توکسین تولید می‌کند. اسپور این باکتری از طریق دستگاه گوارش وارد بدن دام شده و پس از نفوذ به کبد و در صورت فراهم شدن شرایط لازم رشد باکتری و از جمله کم اکسیژنی، آسیب کبدی مانند مهاجرت لارو انگل‌ها، اسپور‌های نهفته فعال شده و تکثیر می‌یابند و توکسین آلفا و بتا را ترشح می‌کند. این توکسین‌ها از نواحی از کبد آسیب دیده گسترش یافته و از طریق جریان خون به اندام‌های حیاتی بدن وارد شده و در نهایت مرگ دام را بدنبال خواهد داشت. بیماری قانقاریای عفونی کبد با خسارات اقتصادی شامل هزینه‌های مرگ و میر گوسفندان، استهلاک مزارع درگیر و مشکلات بهداشتی لاشه‌های آلوده همراه است که تشخیص و جداسازی عامل بیماری با روش‌های مرسوم وقت‌گیر است، لذا نیاز به یک روش ساده و سریع برای جداسازی و تشخیص کلستریدیوم نووئی می‌باشد. بنابراین، این مطالعه با هدف شناسایی مولکولی آلفا توکسین در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از کبد گوسفند انجام گرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه، تعداد 62 نمونه کبد مشکوک به بیماری قانقاریای عفونی کبد (دارای مناطق نکروزه و انگلی) از کشتارگاه‌های ایران (مرند 5، اهواز 8، شهریار 13 و ایلام 36 نمونه) طی سه ماه پایانی سال 1398 و سه ماه ابتدایی سال 1399 جمع‌آوری شد. برای جداسازی باکتری ابتدا تکه‌هایی از قسمت‌های مختلف کبد جدا شد و سلایه گردید و با انجام سانتریفیوژ، مایع‌رویی به عنوان عصاره جمع‌آوری شد. تکه‌های برداشت شده از کبد در محیط کشت مایع جگر (chopped liver broth) کشت داده شد و در شرایط بی‌هوازی، گرم‌خانه گذاری گردید. برای تایید مولکولی، DNA نمونه‌های عصاره بافت با روش فنل-کلروفرم و DNA نمونه‌های کشت داده شده با استفاده از کیت، استخراج گردید. جدایه‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آلفا توکسین، بررسی شدند. جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آنها تشخیص داده شد، جهت تایید بر اساس توالی 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر گردید. جهت جداسازی باکتری، کشت نمونه‌های مثبت بر روی محیط بویون جگر انجام گرفت و در شرایط بی‌هوازی قرار گرفت. جهت از بین بردن باکتری‌های غیر اسپور دار (خالص کردن باکتری)، محیط کشت به مدت 10 دقیقه در °C 100 حرارت داده شد. سپس عصاره بر روی محیط آگار خون‌دار کشت داده شد و پرگنه‌های که همولیز دادند، در محیط فرمانتور غنی جهت افزایش رشد و توکسین‌زایی کشت داده شد. باکتری با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم جهت کنترل گرم مثبت و منفی بودن باکتری و رنگ آمیزی مالاشیت گرین جهت بررسی شکل و نوع اسپور مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن توکسین آلفا در جدایه‌های مثبت تعیین توالی گردید و ردیف‌های نوکلئوتید ژن توکسین آلفا در این جدایه‌ها با توالی‌های هم ارز جدایه‌ها و سویه‌های واکسن که پیش از این تعیین توالی ژنومی شده و در بانک ژن ثبت گردیده‌اند، مقایسه شد.
یافته‌ها: تخم انگل، پس از برش تکه‌های کبد مشکوک و دارای آلودگی انگلی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. پس از گرم‌خانه گذاری در شرایط بی‌هوازی، با رشد باکتری، کلنی‌های باکتری با اشکال نامنظم با حاشیه‌های نامشخص (پلی‌مرف) بر روی محیط آگار و رشد در محیطegg yolk آگار ظاهر شدند و باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای، شکل دهنده اندوسپور در رنگ آمیزی شناسایی شدند. با انجام PCR برای توکسین آلفا، باندی در محدوده 609 جفت باز ایجاد گردید و مشخص شد که 7 نمونه به کلستریدیوم نووئی تعلق دارند. نتایجPCR با استفاده از آغازگرهای مربوط به ژن توکسین آلفا که در تیپ B کلستریدیوم نووئی وجود دارد، نشان داد که از 62 جدایه مشکوک به کلستریدیوم نووئی، 7 جدایه واجد ژن فوق بودند. در ضمن همه عصاره‌های کبد منفی بودند و نمونه‌های مثبت همگی مربوط به نمونه های کشت بودند. صحت جدایه‌هایی که وجود ژن توکسین آلفا در آنها تشخیص داده شد، با PCR-16S rDNA تایید شد. با انجام تعیین توالی برخی از جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آنها تشخیص داده شده بود، شباهت بالایی با ساختار ژنومی آلفا توکسین در میان جدایه‌ها و سویه واکسن وجود داشت.
نتیجه‌گیری: جدا سازی و شناسایی کلستریدیوم نووئی به ندرت موفقیت آمیز است، زیرا باید نمونه تحت شرایط سخت بی‌هوازی سریع به آزمایشگاه منتقل شوند. علاوه بر این به علت ماهیت بی‌هوازی باکتری، تشخیص و جداسازی کلستریدیوم نووئی به سختی امکان پذیر است. به همین دلیل گزارشات بیماری قانقاریای عفونی کبد معمولاً تشخیص احتمالی مبتنی بر آسیب‌شناسی بافتی، آنتی‌بادی فلورسنت یا ایمنوهیستوشیمی می‌باشد. تیپ کلستریدیوم نووئی به سختی تعیین می‌شود. با توجه به اینکه مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم نووئی تیپ B توکسین آلفا می‌باشد، لذا جهت شناسایی جدایه به روش ملکولی از آغازگر ژن توکسین آلفا استفاده شد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد که روش PCR می تواند با شناسایی توکسین آلفا در تشخیص کلستریدیوم نووئی جدایه‌ها کمک کند. در جمع‌بندی یافته‌ها با توجه محدود بودن اطلاعات موجود در ایران از آلودگی گله‌های گوسفند نسبت به کلستریدیوم نووئی و تایید ملکولی و شناسایی جدایه‌های بومی، انجام تحقیقاتی نظیر مطالعه حاضر در آینده می‌تواند به کنترل بیماری و کاهش خسارت‌های احتمالی آن در صنعت دامپروری ایران کمک کند و همچنین جداسازی جدایه ایرانی و ذخیره در مجموعه میکروبی کشور مفید می‌باشد.
مواد و روشها: در این مطالعه، تعداد 62 نمونه کبد مشکوک به بیماری قانقاریای عفونی کبد (دارای مناطق نکروزه و انگلی) از کشتارگاه‌های ایران (مرند 5، اهواز 8، شهریار 13 و ایلام 36 نمونه) طی سه ماه پایانی سال 1398 و سه ماه ابتدایی سال 1399 جمع‌آوری شد. برای جداسازی باکتری ابتدا تکه‌هایی از قسمت‌های مختلف کبد جدا شد و سلایه گردید و با انجام سانتریفیوژ، مایع‌رویی به عنوان عصاره جمع‌آوری شد. تکه‌های برداشت شده از کبد در محیط کشت مایع جگر (chopped liver broth) کشت داده شد و در شرایط بی‌هوازی، گرم‌خانه گذاری گردید. برای تایید مولکولی، DNA نمونه‌های عصاره بافت با روش فنل-کلروفرم و DNA نمونه‌های کشت داده شده با استفاده از کیت، استخراج گردید. جدایه‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آلفا توکسین، بررسی شدند. جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آنها تشخیص داده شد، جهت تایید بر اساس توالی 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر گردید. جهت جداسازی باکتری، کشت نمونه‌های مثبت بر روی محیط بویون جگر انجام گرفت و در شرایط بی‌هوازی قرار گرفت. جهت از بین بردن باکتری‌های غیر اسپور دار (خالص کردن باکتری)، محیط کشت به مدت 10 دقیقه در °C 100 حرارت داده شد. سپس عصاره بر روی محیط آگار خون‌دار کشت داده شد و پرگنه‌های که همولیز دادند، در محیط فرمانتور غنی جهت افزایش رشد و توکسین‌زایی کشت داده شد. باکتری با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم جهت کنترل گرم مثبت و منفی بودن باکتری و رنگ آمیزی مالاشیت گرین جهت بررسی شکل و نوع اسپور مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن توکسین آلفا در جدایه‌های مثبت تعیین توالی گردید و ردیف‌های نوکلئوتید ژن توکسین آلفا در این جدایه‌ها با توالی‌های هم ارز جدایه‌ها و سویه‌های واکسن که پیش از این تعیین توالی ژنومی شده و در بانک ژن ثبت گردیده‌اند، مقایسه شد.
یافته‌ها: تخم انگل، پس از برش تکه‌های کبد مشکوک و دارای آلودگی انگلی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. پس از گرم‌خانه گذاری در شرایط بی‌هوازی، با رشد باکتری، کلنی‌های باکتری با اشکال نامنظم با حاشیه‌های نامشخص (پلی‌مرف) بر روی محیط آگار و رشد در محیطegg yolk آگار ظاهر شدند و باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای، شکل دهنده اندوسپور در رنگ آمیزی شناسایی شدند. با انجام PCR برای توکسین آلفا، باندی در محدوده 609 جفت باز ایجاد گردید و مشخص شد که 7 نمونه به کلستریدیوم نووئی تعلق دارند. نتایجPCR با استفاده از آغازگرهای مربوط به ژن توکسین آلفا که در تیپ B کلستریدیوم نووئی وجود دارد، نشان داد که از 62 جدایه مشکوک به کلستریدیوم نووئی، 7 جدایه واجد ژن فوق بودند. در ضمن همه عصاره‌های کبد منفی بودند و نمونه‌های مثبت همگی مربوط به نمونه های کشت بودند. صحت جدایه‌هایی که وجود ژن توکسین آلفا در آنها تشخیص داده شد، با PCR-16S rDNA تایید شد. با انجام تعیین توالی برخی از جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آنها تشخیص داده شده بود، شباهت بالایی با ساختار ژنومی آلفا توکسین در میان جدایه‌ها و سویه واکسن وجود داشت.
نتیجه‌گیری: جدا سازی و شناسایی کلستریدیوم نووئی به ندرت موفقیت آمیز است، زیرا باید نمونه تحت شرایط سخت بی‌هوازی سریع به آزمایشگاه منتقل شوند. علاوه بر این به علت ماهیت بی‌هوازی باکتری، تشخیص و جداسازی کلستریدیوم نووئی به سختی امکان پذیر است. به همین دلیل گزارشات بیماری قانقاریای عفونی کبد معمولاً تشخیص احتمالی مبتنی بر آسیب‌شناسی بافتی، آنتی‌بادی فلورسنت یا ایمنوهیستوشیمی می‌باشد. تیپ کلستریدیوم نووئی به سختی تعیین می‌شود. با توجه به اینکه مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم نووئی تیپ B توکسین آلفا می‌باشد، لذا جهت شناسایی جدایه به روش ملکولی از آغازگر ژن توکسین آلفا استفاده شد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد که روش PCR می تواند با شناسایی توکسین آلفا در تشخیص کلستریدیوم نووئی جدایه‌ها کمک کند. در جمع‌بندی یافته‌ها با توجه محدود بودن اطلاعات موجود در ایران از آلودگی گله‌های گوسفند نسبت به کلستریدیوم نووئی و تایید ملکولی و شناسایی جدایه‌های بومی، انجام تحقیقاتی نظیر مطالعه حاضر در آینده می‌تواند به کنترل بیماری و کاهش خسارت‌های احتمالی آن در صنعت دامپروری ایران کمک کند و همچنین جداسازی جدایه ایرانی و ذخیره در مجموعه میکروبی کشور مفید می‌باشد.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
