دوره 15، شماره 43 - ( بهار 1403 )
جلد 15 شماره 43 صفحات 94-86 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Nazari M, roshanfekr H, salabi F, fayazi J, mohamadian A, Kavosh F. (2024). Production of the First Effective Immune Equine Serum Antivenom against Iranian Honey Bees (Apis mellifera meda). rap. 15(43), 86-94.
URL: http://rap.sanru.ac.ir/article-1-1343-fa.html
URL: http://rap.sanru.ac.ir/article-1-1343-fa.html
نظری محمود، روشنفکر هدایت اله، ثعلبی فاطمه، فیاضی جمال، محمدیان علی، کاوش فریبا. تولید اولین پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) پژوهشهاي توليدات دامي 1403; 15 (43) :94-86
دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان
چکیده: (176 مشاهده)
چکیده مبسوط
مقدمه و هدف: زهر زنبور عسل ترکیبی مایع، بیرنگ و اسیدی (pH 4.5–5.5) است که شامل 18 ترکیب متفاوت مانند آنزیم ها، پپتیدها و آمینه ای زیستی می باشد. برخی از این ترکیبات دارای خواص ضد التهابی و برخی دارای خواص سمی و آلرژن می‌باشد. مهم ترین پپتیدهای موجود در زهر زنبور ملیتین، آپامین، آدولاپین و پپتید دگرانوله کننده ماست سل هستند. مهمترین آنزیم‌های موجود در زهر زنبور می‌توان هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 را نام برد. زهر زنبور عسل در ادوار گذشته بخصوص در درمان سنتی همواره بهعنوان دارو در درمان بیماریهای مختلفی مانند آرتریت روماتویید و همچنین جهت کاهش دردهای عضلانی مورد استفاده قرار گرفته است. زنبورگزیدگی بهعنوان یکی از مشکلات در سیستم بهداشت عمومی برخی از کشورهای دنیا از جمله ایران مطرح می‌باشد. در حال حاضر درمان خاصی برای زنبور گزیدگی وجود ندارد و درمان تا حدودی توسط داروهای شیمیایی انجام می‌شود. در سال‌های گذشته پادزهر مبتنی بر Fab از اسب و گوسفند بهعنوان یک درمان جدید بالقوه مطرح شده است. تاکنون در ایران اقدامی جهت تولید آنتی‌ونوم (پادزهر) برای نجات افراد حساس به نیش زنبور صورت نگرفته است. لذا هدف از این تحقیق تولید پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) بود.
مواد و روشها: زهر خام از زنبور عسل ایرانی بهوسیله دستگاه زهرگیر تهیه گردید. زهر در مجاورت هوا سریعاً خشک می‌شود. زهر خشک شده هر روز بهکمک کاردک‌های مخصوص از روی صفحات شیشه‌ای جمعآوری و برای استفاده بعدی در شیشه‌های تیره رنگ در فریزر 20- درجه سانتی گراد ذخیره گردید. بههنگام استفاده از سم، برای حذف موکوس و مواد اضافه، سم به نسبت 1 به 1 با محلول سالین (سرم فیزیولوژی) حل شده و با دور بالا سانتریفیوژ می‌گردد. بعد از سانتریفیوژ محلول شفاف بالایی جدا و با فیلتر 0/2 میکرون فیلتر می‌گردد. مقدار پروتئین موجود در محلول زهر خام، بهروش پروتئین سنجی برادفورد و بر اساس منحنی استاندارد حاصل از سنجش غلظت‌های مختلف محلول سرم آلبومین گاوی (BSA) تعیین شد. مقدار متوسط دوز کشندگی (LD50) با 24 موش سوری نر تعیین گردید. موش‌ها به گروه‌های 4 تایی تقسیم شدند و 0/5 میلی‌لیتر از دوزهای مختلف زهر (60، 70، 80، 90، 100 و 110 میکروگرم در میلی‌لیتر) محلول در نرمال سالین استریل بهصورت داخل وریدی به آنها تزریق شد. به موش‌های شاهد 0/5 میلی‌لیتر محلول نمکی تزریق شد. مرگ و میر پس از 24 ساعت ثبت شد و LD50 بر اساس آنالیز پروبیت محاسبه گردید. در این پژوهش از 3 اسب مادیان بالغ 3 ساله (400 تا 450 کیلوگرم) استفاده گردید. برای ایمن سازی اسب‌ها زهر زنبور به همراه ادجوانت فروند کامل و ناقص تزریق گردید. در تلقیح اول و دوم از ادجوانت فروند کامل و در تلقیح‌های بعدی از ادجوانت فروند ناقص استفاده شد. تلقیح سم به صورت افزایشی به ترتیب از 50، 100، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 میکروگرم در طی 7 مرتبه با فواصل زمانی 7 روز اجرا شد. تزریق به صورت زیر پوستی (گردن) انجام شد. جداسازی آنتی بادی اسب با پروتکل استاندارد روش آمونیوم سولفات اشباع شده اجرا شد. ارزیابی ایمنی‌زایی در شرایط آزمایشگاهی با تست الایزا انجام گرفت. سرم اسب‌های ایمن شده و نیز آنتی‌ونوم حاصل از رسوب آمونیوم سولفات اشباع از نظر خنثی‌سازی سم ارزیابی شدند. جهت بررسی کیفیت پادزهر، خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر اجرا شد. در نهایت متوسط دوز موثر (ED50) برای پادزهر در موش سوری تعیین گردید. برای تعیین کارآیی پادزهر اسبی تهیه شده، زهر زنبور بهصورت دوز افزایشی با مقدار ثابت پادزهر مخلوط و به موش تزریق شد.
یافتهها: مقدارLD50 برای زهر زنبور 4/84 میکروگرم برای هر گرم وزن زنده موش بهدست آمد. نتایج تست الیزا نشان داد که روند پاسخ اسب‌ها نسبت به زهر افزایشی بوده و بهخوبی با آنتی ژن ایمن شدهاند. خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر نشان داد که سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و 120 میکروگرم در میلی‌لیتر از این پادزهر قادر به خنثی‌کردن کامل فعالیت سم فسفولیپاز A2 است. از این داده‌ها مشخص است که اولاً سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و دوماً 55 میکروگرم پادزهر برای خنثی‌کردن 50 درصدی فعالیت فسفولیپاز A2 در 100 میکروگرم زهر مورد نیاز است. مقدار ED50 تقریباً 54 برابر LD50 خواهد شد. این بدان معنی است که پادزهر تا 54 برابر LD50 را می‌تواند خنثی کند. بنابراین مرگ ایجاد شده بوسیله 4 میلی‌گرم سم زنبور با 1 میلی‌لیتر پادزهر خنثی می‌شود بههمین دلیل میزان متوسط دوز موثر ED50 برابر با 4 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر خواهد بود. اگر در هر بار نیش زنبور مقدار 100 میکروگرم زهر وارد بدن شود پس 1 میلی‌لیتر از این پادزهر می‌تواند 40 نیش زنبور را خنثی کند.
نتیجه‌گیری: پادزهر سرم اسبی که علیه سم زنبور عسل ایرانی بهدست آمد، در مدل حیوانی قادر به خنثی سازی سم بوده و از مرگ موشهایی که با سم تلقیح شده بودند جلوگیری می‌نماید.
مقدمه و هدف: زهر زنبور عسل ترکیبی مایع، بیرنگ و اسیدی (pH 4.5–5.5) است که شامل 18 ترکیب متفاوت مانند آنزیم ها، پپتیدها و آمینه ای زیستی می باشد. برخی از این ترکیبات دارای خواص ضد التهابی و برخی دارای خواص سمی و آلرژن می‌باشد. مهم ترین پپتیدهای موجود در زهر زنبور ملیتین، آپامین، آدولاپین و پپتید دگرانوله کننده ماست سل هستند. مهمترین آنزیم‌های موجود در زهر زنبور می‌توان هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 را نام برد. زهر زنبور عسل در ادوار گذشته بخصوص در درمان سنتی همواره بهعنوان دارو در درمان بیماریهای مختلفی مانند آرتریت روماتویید و همچنین جهت کاهش دردهای عضلانی مورد استفاده قرار گرفته است. زنبورگزیدگی بهعنوان یکی از مشکلات در سیستم بهداشت عمومی برخی از کشورهای دنیا از جمله ایران مطرح می‌باشد. در حال حاضر درمان خاصی برای زنبور گزیدگی وجود ندارد و درمان تا حدودی توسط داروهای شیمیایی انجام می‌شود. در سال‌های گذشته پادزهر مبتنی بر Fab از اسب و گوسفند بهعنوان یک درمان جدید بالقوه مطرح شده است. تاکنون در ایران اقدامی جهت تولید آنتی‌ونوم (پادزهر) برای نجات افراد حساس به نیش زنبور صورت نگرفته است. لذا هدف از این تحقیق تولید پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) بود.
مواد و روشها: زهر خام از زنبور عسل ایرانی بهوسیله دستگاه زهرگیر تهیه گردید. زهر در مجاورت هوا سریعاً خشک می‌شود. زهر خشک شده هر روز بهکمک کاردک‌های مخصوص از روی صفحات شیشه‌ای جمعآوری و برای استفاده بعدی در شیشه‌های تیره رنگ در فریزر 20- درجه سانتی گراد ذخیره گردید. بههنگام استفاده از سم، برای حذف موکوس و مواد اضافه، سم به نسبت 1 به 1 با محلول سالین (سرم فیزیولوژی) حل شده و با دور بالا سانتریفیوژ می‌گردد. بعد از سانتریفیوژ محلول شفاف بالایی جدا و با فیلتر 0/2 میکرون فیلتر می‌گردد. مقدار پروتئین موجود در محلول زهر خام، بهروش پروتئین سنجی برادفورد و بر اساس منحنی استاندارد حاصل از سنجش غلظت‌های مختلف محلول سرم آلبومین گاوی (BSA) تعیین شد. مقدار متوسط دوز کشندگی (LD50) با 24 موش سوری نر تعیین گردید. موش‌ها به گروه‌های 4 تایی تقسیم شدند و 0/5 میلی‌لیتر از دوزهای مختلف زهر (60، 70، 80، 90، 100 و 110 میکروگرم در میلی‌لیتر) محلول در نرمال سالین استریل بهصورت داخل وریدی به آنها تزریق شد. به موش‌های شاهد 0/5 میلی‌لیتر محلول نمکی تزریق شد. مرگ و میر پس از 24 ساعت ثبت شد و LD50 بر اساس آنالیز پروبیت محاسبه گردید. در این پژوهش از 3 اسب مادیان بالغ 3 ساله (400 تا 450 کیلوگرم) استفاده گردید. برای ایمن سازی اسب‌ها زهر زنبور به همراه ادجوانت فروند کامل و ناقص تزریق گردید. در تلقیح اول و دوم از ادجوانت فروند کامل و در تلقیح‌های بعدی از ادجوانت فروند ناقص استفاده شد. تلقیح سم به صورت افزایشی به ترتیب از 50، 100، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 میکروگرم در طی 7 مرتبه با فواصل زمانی 7 روز اجرا شد. تزریق به صورت زیر پوستی (گردن) انجام شد. جداسازی آنتی بادی اسب با پروتکل استاندارد روش آمونیوم سولفات اشباع شده اجرا شد. ارزیابی ایمنی‌زایی در شرایط آزمایشگاهی با تست الایزا انجام گرفت. سرم اسب‌های ایمن شده و نیز آنتی‌ونوم حاصل از رسوب آمونیوم سولفات اشباع از نظر خنثی‌سازی سم ارزیابی شدند. جهت بررسی کیفیت پادزهر، خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر اجرا شد. در نهایت متوسط دوز موثر (ED50) برای پادزهر در موش سوری تعیین گردید. برای تعیین کارآیی پادزهر اسبی تهیه شده، زهر زنبور بهصورت دوز افزایشی با مقدار ثابت پادزهر مخلوط و به موش تزریق شد.
یافتهها: مقدارLD50 برای زهر زنبور 4/84 میکروگرم برای هر گرم وزن زنده موش بهدست آمد. نتایج تست الیزا نشان داد که روند پاسخ اسب‌ها نسبت به زهر افزایشی بوده و بهخوبی با آنتی ژن ایمن شدهاند. خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر نشان داد که سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و 120 میکروگرم در میلی‌لیتر از این پادزهر قادر به خنثی‌کردن کامل فعالیت سم فسفولیپاز A2 است. از این داده‌ها مشخص است که اولاً سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و دوماً 55 میکروگرم پادزهر برای خنثی‌کردن 50 درصدی فعالیت فسفولیپاز A2 در 100 میکروگرم زهر مورد نیاز است. مقدار ED50 تقریباً 54 برابر LD50 خواهد شد. این بدان معنی است که پادزهر تا 54 برابر LD50 را می‌تواند خنثی کند. بنابراین مرگ ایجاد شده بوسیله 4 میلی‌گرم سم زنبور با 1 میلی‌لیتر پادزهر خنثی می‌شود بههمین دلیل میزان متوسط دوز موثر ED50 برابر با 4 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر خواهد بود. اگر در هر بار نیش زنبور مقدار 100 میکروگرم زهر وارد بدن شود پس 1 میلی‌لیتر از این پادزهر می‌تواند 40 نیش زنبور را خنثی کند.
نتیجه‌گیری: پادزهر سرم اسبی که علیه سم زنبور عسل ایرانی بهدست آمد، در مدل حیوانی قادر به خنثی سازی سم بوده و از مرگ موشهایی که با سم تلقیح شده بودند جلوگیری می‌نماید.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
مدیریت دامپروری و تولید
دریافت: 1401/9/15 | ویرایش نهایی: 1403/2/8 | پذیرش: 1402/6/22 | انتشار: 1403/2/8
دریافت: 1401/9/15 | ویرایش نهایی: 1403/2/8 | پذیرش: 1402/6/22 | انتشار: 1403/2/8
فهرست منابع
1. Abdel-Monsef, M. M., Zidan, H. Darwish, D. A. Masoud, H. M. Helmy, M. S. & Ibrahim, M. A. (2020). Biochemical Isolation and Characterization of Hyaluronidase Enzyme from Venom of Egyptian Honey Bee Apis Mellifera Lamarckii. Journal of Apicultural Science, 64(1), 153-164. [DOI:10.2478/jas-2020-0015]
2. Alia, O., Laila, M. & Antonios, A. (2013). Antimicrobial effect of melittin isolated from Syrian honeybee (Apis mellifera) venom and its wound healing potential. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 21, 318-324.
3. Barbosa, A.N., Boyer, L., Chippaux, J.P., Medolago, N. B., Caramori, C. A., Paixão, A. G., Vasconcelos Poli, J. P., Mendes, L. B., Santos, L. D., Ferreira, R. S., Barraviera, B. (2017). A clinical trial protocol to treat massive Africanized honeybee (Apis mellifera) attack with a new apilic antivenom. Journal of Venomous Animals and Toxins, 23, 14. [DOI:10.1186/s40409-017-0106-y]
4. Behdani, M., Hosseininejad chafi, M., Zeinali, S., Karimipour, M., Khanahmad, S. H., Ghasemi, P., Asadzadeh, N., Ghamnak, A., Pooshang Bagheri, K., Ahari, H., & Shahbazzadeh, D. (2010). Antiserum production in immunized camel by the venom of Hemiscorpius lepturus scorpion: evaluation of neutralizing test in vivo. Tehran University Medical Journal, 68(5), 268-273 (In Persian).
5. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1), 248-54. [DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3]
6. Czarnetzki, B. M., Thiele, T. & Rosenbach, T. (1990). Evidence for leukotrienes in animal venoms. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 85(2), 505-509. [DOI:10.1016/0091-6749(90)90162-W]
7. De Graaf, D. C., Brochetto Braga, M. R., de Abreu, R. M. M., Blank, S., Bridts, C. H., De Clerck, L. S., Devreese, B., Ebo, D. G., Ferris, T. J., Hagendorens, M. M., & Justo Jacomini, D. L. (2020). Standard methods for Apis mellifera venom research. Journal of Apicultural Research, 60(4), 1-31. [DOI:10.1080/00218839.2020.1801073]
8. Darwish, D.A., Masoud, H.M.M., Abdel-Monsef, M.M., Helmy, M.S., Zidan, H.A., & Ibrahim, M.A. (2021). Phospholipase A2 enzyme from the venom of Egyptian honey bee Apis mellifera lamarckii with anti-platelet aggregation and anti-coagulation activities. J Genet Eng Biotechnol, 19(1), 10. [DOI:10.1186/s43141-020-00112-z]
9. El Mehdi, I., Falcão, S.I., Boujraf, S., Mustapha, H., Campos, M.G., & Vilas-Boas, M. (2022). Analytical methods for honeybee venom characterization. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology and Research, 13, 154-60.
10. Finney, D. J. (1971). Probit analysis. 3d Ed. Cambridge University Press.
11. Ghabili, K., Shoja, M.M., & Parvizi, M. (2009). Bee venom therapy: a probable etiology of aneurysm formation in aorta. Med Hypotheses, 73(3), 459-60. [DOI:10.1016/j.mehy.2009.03.022]
12. Greenfield, E.A. (2018). Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. pdb. prot098202. [DOI:10.1101/pdb.prot098202]
13. Grodzki, A.C., & Berenstein, E. (2010). Antibody purification: ammonium sulfate fractionation or gel filtration. Methods in Molecular Biology, 588, 15-26. [DOI:10.1007/978-1-59745-324-0_3]
14. Hall, J. E. (2010). Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology (Guyton Physiology). Saunders Publisher. 12th edition. [DOI:10.1016/B978-1-4160-5452-8.00024-X]
15. Ismael, B.N., Abass, K.S., Khalil, K.A., & Salih K.A. (2018). Preparation of F (ab')2 antivenom in Iraq against scorpion (Hottentotta saulcyi) venom. Biologicals, 56, 19-23. [DOI:10.1016/j.biologicals.2018.08.005]
16. Jones, R.G., Corteling, R.L., Bhogal, G., & Landon, J. (1999). A novel Fab-based antivenom for the treatment of mass bee attacks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 61(3), 361-6. [DOI:10.4269/ajtmh.1999.61.361]
17. Lima, P.R. & Brochetto-Braga, M.R. (2003). Hymenoptera venom review focusing on Apis mellifera. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis, 9, 149-162. [DOI:10.1590/S1678-91992003000200002]
18. Marinetti, G. V. (1965). The action of phospholipase A2 on lipoproteins. Biochem Biophys Acta, 98, 554-6. [DOI:10.1016/0005-2760(65)90152-9]
19. Marinho, J.B.R., & Soto-Blanco, B. (2020). Toxicological Risk Assessment of the Accidental Ingestion of a Honeybee (Apis mellifera L.) Present in Food. Front in Veterinary Science, 7, 583286. [DOI:10.3389/fvets.2020.583286]
20. Mohamadi ahvazi, Gh., Nazari, M., Mohamadabadi, M.R., & Heidari, R. (2019). Genetic and phylogenetic analysis of mitochondrial HVR1 region in three breeds of Iranian sheep. Mod Genet J, 14(3), 211-219 (In Persian).
21. Morammazi, S., & Mirhosseini, M.A. (2020). Expression of HSP90 Gene and its Relationship with Ambient Temperature and Foraging Rate in Apis Mellifera Meda. Agricultural Biotechnology Journal, 12 (4), 185-205 (In Persian).
22. Nazari, M., Roshanfekr, H. & Salabi, F. (2023). Isolation, characterization, and biological activity of Phospholipase A2 (PLA2) and Hyaluronidase from Iranian honey bee venom (Apis Mellifera meda). Agricultural Biotechnology Journal, 15 (2), 1-22 (In Persian).
23. Norooz Valashedi, R., & Bahrami Pichaghchi, H. (2022). Investigating the Effect of Climate Indices on the Number of Beehives in the Last Six Climatic Decades. Research on animal production, 13 (37), 187-195 (In Persian). [DOI:10.52547/rap.13.37.187]
24. Pattabhiramaiah, M., Ramesh, K., Vishwanath, K.V., & Reddy, S. (2020). Computational analysis of PhospholipaseA2 in the honey bee venom. Journal of Apicultural Research, 59(4), 706-721. [DOI:10.1080/00218839.2020.1754589]
25. Rohipoor, M., Nazari, M., & Beigi Nassiri, M.T. (2019). Genetic and Phylogenetic Analysis of Adani Goat Population Based on Cytochrome B Gene. Research on animal production, 10 (26), 84-89 (In Persian). [DOI:10.29252/rap.10.26.84]
26. Rohipoor, M., Nazari, M., & Beigi nassiri, M.T. (2021) Population structure, Genetic diversity and phylogenetic analysis of control region of mtDNA in Adani goat breed. Mod Genet J, 15(4), 297-304 (In Persian).
27. Santos, K. S., Stephano, M. A., Marcelino, J. R., Resende Ferreira, V. M., Rocha, T., Caricati, C., Higashi, H. G., Moro, A. M., Kalil, J. E., Malaspina, O., Morato Castro, F. F., & Palma, M. S. (2013) Production of the First Effective Hyper Immune Equine Serum Anti venom against Africanized Bees. PLoS ONE, 8(11), e79971. [DOI:10.1371/journal.pone.0079971]
28. Schumacher, M.J., Egen, N.B., & Tanner, D. (1996). Neutralization of bee venom lethality by immune serum antibodies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 55, 197- 201. [DOI:10.4269/ajtmh.1996.55.197]
29. Winston, M. L. (1991). The Biology of the Honey Bee. Harvard University Press; Cambridge. London. 4th Edition
30. Zolfagharian, H., Mohajeri, M., Babaie, M., Mosavari, N., & Javadi, I. (2016). Investigation of the Antibacterial Effect of Crude Venom of Honey Bee (Apis mellifera) and its Fractions by Disk Diffusion Method. Veterinary Journal (Pajouhesh & Sazandegi), 114, 117-126 (In Persian).
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
