چکیده مبسوط
مقدمه و هدف: تلقیح مصنوعی یکی از ابزارهای مدیریتی مهم برای کنترل فعالیت های تولیدمثلی و افزایش بازده صنعت پرورش دام میباشد. این تکنیک می تواند نقش مهمی در پیشرفت ژنتیکی حتی در گلههای کوچک میشود. آمادهسازی اسپرم جهت اجرای تکنیکهای تولیدمثلی مانند تلقیح مصنوعی از اهمیت ویژهای برخوردار است. اما در طول آمادهسازی و نگهداری اسپرم، عوامل متعدد آسیب زا مانند شوک دمایی و تنش اکسیداتیو موجب کاهش کیفیت اسپرمها شده و بهطور مستقیم باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار میدهند. لذا افزودن مواد محافظتکننده و آنتیاکسیدان در رقیقکننده امری ضروری در حفظ کیفیت اسپرم در مراحل سردسازی و انجماد محسوب میشود.کورکومین ماده زرد رنگی است که از ریشه زردچوبه حاصل میشود واز نظر ساختار بیوشیمیایی با داشتن حلقه فنلی و بخش بتا دی-کتونی در ساختمان خود میتواند رادیکالهای آزاد را خنثی کند ولی در محیطهای آبدوست حلالیت پایینی دارد. جهت رفع این مشکل، روش نانولیپوزوم پیشنهاد شده است که با بهرهگیری از این روش، علاوه بر رفع مشکل حلالیت پایین کورکومین در محلولهای آبی، نانوذرات کورکومین بصورت کاملا هدفمند به داخل سلول هدف هدایت و تاثیرات خود را انجام میدهد. از طرف دیگر قند ساکارز با آبکشی اولیه سلولهای اسپرم و حفظ فشار اسمزی محیط رقیق کننده، اسپرمها را از شوک سرمایی محافظت میکند. هدف از انجام این مطالعه، بررسی اثرات استفاده جداگانه و مخلوط سطوح مختلف نانو ذرات کورکومین و قند ساکارز در رقیقکننده اسپرم اپیدیدمی قوچ طی نگهداری در دمای C˚۵ در زمانهای مختلف سردسازی بود.
مواد و روشها: مطالعه حاضر در آزمایشگاه فیزیولوژی دام گروه علوم دام و طیور پردیس کشاورزی ابوریحان دانشگاه تهران انجام شد. بافتهای بیضه در روز آزمایش از کشتارگاه تهیه و بهوسیله فلاکس مخصوص در فاصله کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه منتقل شدند. اسپرم از ناحیه دم اپیدیدیم بافت بیضه قوچ در آزمایشگاه جمعآوری شد. نمونههای اسپرم پس از ارزیابی اوّلیه و دارا بودن تحرک پیشرونده ببیش از ۷۵ درصد و ناهنجاری کمتر از ۱۰ درصد انتخاب و در دمای ۳۷ درجه
سانتی گراد به رقیقکننده افزوده شدند. ترکیب رقیق کننده در این مطالعه شامل: تریس ۲۷/۱ گرم در لیتر، اسید سـیتریک ۱۴ گـرم در لیتر، فروکتوز ۱۰ گرم در لیتر، زرده تخممرغ ۲۰ درصد، گلیسـرول ۷ درصدبود که PH رقیق کننده در حدود ۶/۸ – ۷/۲ و اسمولاریته در حدود ۳۱۰- ۳۲۰ میلی اسمول تنظیم گردید. قند ساکارز ساخت شرکت سیگما آلدریج تهیه شد و نانوذرات کورکومین نیز از پودر کورکومین خالص ساخت شرکت سیگما آلدریج به روش نانولیپوزوم و با استفاده از دستگاه های روتاری، هموژنایزر و سونیکاتور پروپ تهیه شد. برای بررسی اندازه ذرات نانوذرات کورکومین نیز از دستگاه DLS استفاده شد و ذرات در حدود کمتر از ۸۰ نانوگرم بودند. گروههای آزمایشی شامل غلظتهای ۲۵ و ۵۰ میکرومولار نانوذرات کورکومین (NC)، ساکارز (S) در دو غلظت ۱۰۰ و ۱۵۰ میلیمولار بصورت جداگانه، سطوح ترکیبی شامل (۲۵NC۱۰۰S، ۲۵NC۱۵۰S، ۵۰NC۱۰۰S، ۵۰NC۱۵۰S) و یک گروه فاقد این افزودنیها (شاهد) بودند که در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به رقیقکننده اضافه شدند. رقیقکنندههای حاوی سطوح مختلف تیماری در فالکونهای ۱۵ میلیلیتر و در داخل ظرف آب هم دما به داخل یخچال منتقل شدند که بهصورت تدریجی در طول حدود ۲ ساعت به دمای C˚۵ رسیدند. پس از تثبیت در این دما، در زمانهای ۶، ۱۲، ۲۴ و ۴۸ ساعت، پارامترهای جنبایی کل، جنبایی پیشرونده با استفاده از سیستم کاسا، زندهمانی با روش ائوزین- نیگروزین (۱۶/۷ گرم ائوزین، ۱۰۰ گرم نیگروزین، ۲۹ گرم بافر سیترات در یک لیتر آب دوبار تقطیر)، یکپارچگی غشایی با روش محلول HOST (۹ گرم فروکتوز، ۴/۹ گرم سیترات سدیم در یک لیتر آب دو بار تقطیر با اسمولاریته ۱۰۰ میلی اسمول) و درصد ناهنجاریهای اسپرم با استفاده از محلول هانکوک (۶۲/۵ لیتر فرمالین ۳۷ درصد، ۱۵۰ میلیلیتر محلول سالین، ۱۵۰ میلیلیتر محلول بافر و ۵۰۰ میلیلیتر آب دو بار تقطیر) ارزیابی شدند. نتایج حاصل از آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی بهوسیله نرم افزار SAS (۹/۲) و رویه GLM آنالیز و سطح معنیداری (۰/۰۵P<) در نظر گرفته شد. برای مقایسه میانگین تیمارها نیز از آزمون توکی استفاده شد.
یافتهها: نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از۲۵NC۱۰۰S در رقیق کننده موجب بهبود پارامترهای جنبایی کل، جنبایی پیشرونده، زندهمانی و یکپارچگی غشای اسپرم اپیدیدیمی قوچ در تمامی زمانهای مورد ارزیابی نسبت به سایر گروهها بخصوص گروه شاهد شد (۰/۰۵p<). در مورد درصد ناهنجاریهای اسپرم در زمانهای ۶ و ۱۲ ساعت بین تیمارها تفاوت معنیداری مشاهده نشد (۰/۰۵p>) ولی در زمانهای ۲۴ و ۴۸ ساعت غلظت۲۵NC۱۰۰S موجب کاهش معنیدار درصد ناهنجاریهای اسپرم نسبت به سایر غلظتها شد (۰/۰۵P<). افزودن سطوح مختلف نانوذرات کورکومین و قند ساکارز بصورت جداگانه نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری پارامترهای مورد ارزیابی را بهبود داده بودند ولی بهترین عملکرد در تیمار ترکیبی مشاهده شد که می تواند نشان دهنده نقش هم افزایی این دو ترکیب باشد.
نتیجهگیری: نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از مخلوط نانوذرات کورکومین با ساکارز در رقیقکننده میتواند اسپرمها را در برابر آسیبهای اکسیداتیو و شوک سرمایی محافظت کند. اثرات آنتیاکسیدانی نانوذرات کورکومین و اثرات محافظتی قند ساکارز میتواند علت تاثیر مثبت بر کیفیت اسپرم اپیدیدیمی قوچ در زمانهای سردسازی باشد و از این رو استفاده از سطح ۲۵NC۱۰۰S در رقیق کننده اسپرم قوچ توصیه میشود.