دوره 16، شماره 2 - ( تابستان 1404 )
جلد 16 شماره 2 صفحات 145-138 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Emadi A, Pourbakhsh S A, Fathi Najafi M, Jamshidian M, Amini K. (2025). Identification of Alpha Toxin in Iranian Clostridium novyi Isolates from Slaughterhouse Samples. Res Anim Prod. 16(2), 138-145. doi:10.61882/rap.2024.1456
URL: http://rap.sanru.ac.ir/article-1-1456-fa.html
URL: http://rap.sanru.ac.ir/article-1-1456-fa.html
عمادی آناهیتا، پور بخش سید علی، فتحی‌نجفی محسن، جمشیدیان محمود، امینی کیومرث. شناسایی توکسین آلفا در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از نمونه‌های کشتارگاهی پژوهشهاي توليدات دامي 1404; 16 (2) :145-138 10.61882/rap.2024.1456
1- گروه پاتوبیولوژی، دانشکده علوم دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
2- مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
چکیده: (498 مشاهده)
چکیده مبسوط
مقدمه و هدف: باکتری کلستریدیوم نووئی نوع B عامل بیماری قانقاریای عفونی کبد (Black disease) در گوسفند و بز است. این باکتری سم سلولی بهنام آلفا توکسین تولید می‌کند. اسپور این باکتری از طریق دستگاه گوارش وارد بدن دام شده، پس از نفوذ به کبد و در صورت فراهم شدن شرایط لازم رشد باکتری و از جمله کماکسیژنی، آسیب کبدی مانند مهاجرت لارو انگل‌ها، اسپور‌های نهفته فعال شده، تکثیر می‌یابند و توکسین آلفا و بتا را ترشح می‌کنند. این توکسین‌ها از نواحی از کبد آسیبدیده گسترش می‌یابند، از طریق جریان خون به اندام‌های حیاتی بدن وارد شده، و در نهایت مرگ دام را بهدنبال خواهد داشت. بیماری قانقاریای عفونی کبد با خسارات اقتصادی شامل هزینه‌های مرگ و میر گوسفندان، استهلاک مزارع درگیر و مشکلات بهداشتی لاشه‌های آلوده همراه است که تشخیص و جداسازی عامل بیماری با روش‌های مرسوم وقت‌گیر است، لذا نیاز به یک روش ساده و سریع برای جداسازی و تشخیص کلستریدیوم نووئی وجود دارد. بنابراین، این مطالعه با هدف شناسایی مولکولی آلفا توکسین در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از کبد گوسفند انجامگرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه، تعداد 62 نمونه کبد مشکوک به بیماری قانقاریای عفونی کبد (دارای مناطق نکروزه و انگلی) از کشتارگاه‌های ایران (مرند 5، اهواز 8، شهریار 13 و ایلام 36 نمونه) طی سه ماه پایانی سال 1398 و سه ماه ابتدایی سال 1399 جمع‌آوری شدند. برای جداسازی باکتری، ابتدا تکه‌هایی از قسمت‌های مختلف کبد جدا شدند و سلایه گردیدند و با انجام سانتریفیوژ، مایع‌رویی بهعنوان عصاره جمع‌آوری شد. تکه‌های برداشت شده از کبد در محیط کشت مایع جگر (chopped liver broth) کشت داده شدند و در شرایط بی‌هوازی، گرمخانهگذاری گردیدند. برای تایید مولکولی، DNA نمونه‌های عصاره بافت با روش فنل-کلروفرم و DNA نمونه‌های کشتداده شده با استفاده از کیت، استخراج گردیدند. جدایه‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آلفا توکسین، بررسی شدند. جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن‌ها تشخیص داده شد، جهت تأیید براساس توالی 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر گردید. جهت جداسازی باکتری، کشت نمونه‌های مثبت بر روی محیط بویون جگر انجام و در شرایط بی‌هوازی قرار گرفت. جهت از بین بردن باکتری‌های غیر اسپوردار (خالص کردن باکتری)، محیط کشت بهمدت 10 دقیقه در °C 100 حرارت داده شد. سپس، عصاره بر روی محیط آگار خون‌دار کشت داده شد و پرگنه‌هایی که همولیز دادند، در محیط فرمانتور غنی جهت افزایش رشد و توکسین‌زایی کشت داده شدند. باکتری با استفاده از رنگآمیزی گرم جهت کنترل گرم مثبت و منفی بودن باکتری و رنگ آمیزی مالاشیت گرین جهت بررسی شکل و نوع اسپور مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن توکسین آلفا در جدایه‌های مثبت تعیین توالی گردید و ردیف‌های نوکلئوتید ژن توکسین آلفا در این جدایه‌ها با توالی‌های همارز جدایه‌ها و سویه‌های واکسن که پیش از این تعیین توالی ژنومی شده و در بانک ژن ثبت گردیده‌اند، مقایسه شدند.
یافته‌ها: تخم انگل، پس از برش تکه‌های کبد مشکوک و دارای آلودگی انگلی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. پس از گرمخانهگذاری در شرایط بی‌هوازی، با رشد باکتری، کلنی‌های باکتری با اشکال نامنظم با حاشیه‌های نامشخص (پلی‌مورف) بر روی محیط آگار و رشد در محیطegg yolk آگار ظاهر شدند و باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای، شکل دهنده اندوسپور در رنگآمیزی شناسایی شدند. با انجام PCR برای توکسین آلفا، باندی در محدوده 609 جفت باز ایجاد گردید و مشخص شد که هفت نمونه به کلستریدیوم نووئی تعلق داشتند. نتایجPCR با استفاده از آغازگرهای مربوط به ژن توکسین آلفا که در تیپ B کلستریدیوم نووئی وجود دارد، نشان دادند که از 62 جدایه مشکوک به کلستریدیوم نووئی، هفت جدایه واجد ژن فوق بودند. در ضمن، همه عصاره‌های کبد منفی بودند و نمونه‌های مثبت همگی مربوط به نمونه‌های کشت بودند. صحت جدایه‌هایی که وجود ژن توکسین آلفا در آن‌ها تشخیص داده شد، با PCR-16S rDNA تایید شد. با انجام تعیین توالی برخی از جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن‌ها تشخیص داده شده بود، شباهت بالایی با ساختار ژنومی آلفاتوکسین در میان جدایه‌ها و سویه واکسن وجود داشت.
نتیجه‌گیری: جداسازی و شناسایی کلستریدیوم نووئی بهندرت موفقیتآمیز است زیرا باید نمونه تحت شرایط سخت بی‌هوازی سریع به آزمایشگاه منتقل شوند. علاوه بر این، بهعلت ماهیت بی‌هوازی باکتری، تشخیص و جداسازی کلستریدیوم نووئی بهسختی امکانپذیر است. بههمین دلیل، گزارشات بیماری قانقاریای عفونی کبد معمولاً تشخیص احتمالی مبتنی بر آسیب‌شناسی بافتی، آنتی‌بادی فلورسنت یا ایمنوهیستوشیمی هستند. تیپ کلستریدیوم نووئی بهسختی تعیین می‌شود. با توجه به اینکه مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم نووئی تیپ B توکسین آلفا است، لذا جهت شناسایی جدایه بهروش مولکولی از آغازگر ژن توکسین آلفا استفاده شد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان میدهند که روش PCR می‌تواند با شناسایی توکسین آلفا در تشخیص کلستریدیوم نووئی جدایه‌ها کمک کند. در جمع‌بندی یافته‌ها، با توجه محدودبودن اطلاعات موجود در ایران از آلودگی گله‌های گوسفند نسبت به کلستریدیوم نووئی و تأیید مولکولی و شناسایی جدایه‌های بومی، انجام تحقیقاتی نظیر مطالعه حاضر در آینده می‌تواند به کنترل بیماری و کاهش خسارت‌های احتمالی آن در صنعت دامپروری ایران کمک کند و همچنین جداسازی جدایه ایرانی و ذخیره در مجموعه میکروبی کشور مفید است.
مقدمه و هدف: باکتری کلستریدیوم نووئی نوع B عامل بیماری قانقاریای عفونی کبد (Black disease) در گوسفند و بز است. این باکتری سم سلولی بهنام آلفا توکسین تولید می‌کند. اسپور این باکتری از طریق دستگاه گوارش وارد بدن دام شده، پس از نفوذ به کبد و در صورت فراهم شدن شرایط لازم رشد باکتری و از جمله کماکسیژنی، آسیب کبدی مانند مهاجرت لارو انگل‌ها، اسپور‌های نهفته فعال شده، تکثیر می‌یابند و توکسین آلفا و بتا را ترشح می‌کنند. این توکسین‌ها از نواحی از کبد آسیبدیده گسترش می‌یابند، از طریق جریان خون به اندام‌های حیاتی بدن وارد شده، و در نهایت مرگ دام را بهدنبال خواهد داشت. بیماری قانقاریای عفونی کبد با خسارات اقتصادی شامل هزینه‌های مرگ و میر گوسفندان، استهلاک مزارع درگیر و مشکلات بهداشتی لاشه‌های آلوده همراه است که تشخیص و جداسازی عامل بیماری با روش‌های مرسوم وقت‌گیر است، لذا نیاز به یک روش ساده و سریع برای جداسازی و تشخیص کلستریدیوم نووئی وجود دارد. بنابراین، این مطالعه با هدف شناسایی مولکولی آلفا توکسین در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از کبد گوسفند انجامگرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه، تعداد 62 نمونه کبد مشکوک به بیماری قانقاریای عفونی کبد (دارای مناطق نکروزه و انگلی) از کشتارگاه‌های ایران (مرند 5، اهواز 8، شهریار 13 و ایلام 36 نمونه) طی سه ماه پایانی سال 1398 و سه ماه ابتدایی سال 1399 جمع‌آوری شدند. برای جداسازی باکتری، ابتدا تکه‌هایی از قسمت‌های مختلف کبد جدا شدند و سلایه گردیدند و با انجام سانتریفیوژ، مایع‌رویی بهعنوان عصاره جمع‌آوری شد. تکه‌های برداشت شده از کبد در محیط کشت مایع جگر (chopped liver broth) کشت داده شدند و در شرایط بی‌هوازی، گرمخانهگذاری گردیدند. برای تایید مولکولی، DNA نمونه‌های عصاره بافت با روش فنل-کلروفرم و DNA نمونه‌های کشتداده شده با استفاده از کیت، استخراج گردیدند. جدایه‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آلفا توکسین، بررسی شدند. جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن‌ها تشخیص داده شد، جهت تأیید براساس توالی 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر گردید. جهت جداسازی باکتری، کشت نمونه‌های مثبت بر روی محیط بویون جگر انجام و در شرایط بی‌هوازی قرار گرفت. جهت از بین بردن باکتری‌های غیر اسپوردار (خالص کردن باکتری)، محیط کشت بهمدت 10 دقیقه در °C 100 حرارت داده شد. سپس، عصاره بر روی محیط آگار خون‌دار کشت داده شد و پرگنه‌هایی که همولیز دادند، در محیط فرمانتور غنی جهت افزایش رشد و توکسین‌زایی کشت داده شدند. باکتری با استفاده از رنگآمیزی گرم جهت کنترل گرم مثبت و منفی بودن باکتری و رنگ آمیزی مالاشیت گرین جهت بررسی شکل و نوع اسپور مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن توکسین آلفا در جدایه‌های مثبت تعیین توالی گردید و ردیف‌های نوکلئوتید ژن توکسین آلفا در این جدایه‌ها با توالی‌های همارز جدایه‌ها و سویه‌های واکسن که پیش از این تعیین توالی ژنومی شده و در بانک ژن ثبت گردیده‌اند، مقایسه شدند.
یافته‌ها: تخم انگل، پس از برش تکه‌های کبد مشکوک و دارای آلودگی انگلی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. پس از گرمخانهگذاری در شرایط بی‌هوازی، با رشد باکتری، کلنی‌های باکتری با اشکال نامنظم با حاشیه‌های نامشخص (پلی‌مورف) بر روی محیط آگار و رشد در محیطegg yolk آگار ظاهر شدند و باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای، شکل دهنده اندوسپور در رنگآمیزی شناسایی شدند. با انجام PCR برای توکسین آلفا، باندی در محدوده 609 جفت باز ایجاد گردید و مشخص شد که هفت نمونه به کلستریدیوم نووئی تعلق داشتند. نتایجPCR با استفاده از آغازگرهای مربوط به ژن توکسین آلفا که در تیپ B کلستریدیوم نووئی وجود دارد، نشان دادند که از 62 جدایه مشکوک به کلستریدیوم نووئی، هفت جدایه واجد ژن فوق بودند. در ضمن، همه عصاره‌های کبد منفی بودند و نمونه‌های مثبت همگی مربوط به نمونه‌های کشت بودند. صحت جدایه‌هایی که وجود ژن توکسین آلفا در آن‌ها تشخیص داده شد، با PCR-16S rDNA تایید شد. با انجام تعیین توالی برخی از جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن‌ها تشخیص داده شده بود، شباهت بالایی با ساختار ژنومی آلفاتوکسین در میان جدایه‌ها و سویه واکسن وجود داشت.
نتیجه‌گیری: جداسازی و شناسایی کلستریدیوم نووئی بهندرت موفقیتآمیز است زیرا باید نمونه تحت شرایط سخت بی‌هوازی سریع به آزمایشگاه منتقل شوند. علاوه بر این، بهعلت ماهیت بی‌هوازی باکتری، تشخیص و جداسازی کلستریدیوم نووئی بهسختی امکانپذیر است. بههمین دلیل، گزارشات بیماری قانقاریای عفونی کبد معمولاً تشخیص احتمالی مبتنی بر آسیب‌شناسی بافتی، آنتی‌بادی فلورسنت یا ایمنوهیستوشیمی هستند. تیپ کلستریدیوم نووئی بهسختی تعیین می‌شود. با توجه به اینکه مهمترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم نووئی تیپ B توکسین آلفا است، لذا جهت شناسایی جدایه بهروش مولکولی از آغازگر ژن توکسین آلفا استفاده شد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان میدهند که روش PCR می‌تواند با شناسایی توکسین آلفا در تشخیص کلستریدیوم نووئی جدایه‌ها کمک کند. در جمع‌بندی یافته‌ها، با توجه محدودبودن اطلاعات موجود در ایران از آلودگی گله‌های گوسفند نسبت به کلستریدیوم نووئی و تأیید مولکولی و شناسایی جدایه‌های بومی، انجام تحقیقاتی نظیر مطالعه حاضر در آینده می‌تواند به کنترل بیماری و کاهش خسارت‌های احتمالی آن در صنعت دامپروری ایران کمک کند و همچنین جداسازی جدایه ایرانی و ذخیره در مجموعه میکروبی کشور مفید است.
فهرست منابع
1. Abdolmohammadi Khiav, L., & Zahmatkesh, A. (2021). Vaccination against pathogenic clostridia in animals: a review. Tropical Animal Health and Production, 53(2), 284-294. [DOI:10.1007/s11250-021-02728-w]
2. Amimoto, K., Sasaki, O., Isogai, M., Kitajima, T., Oishi, E., Okada, N., & Yasuhara, H. (1998). The protective effect of Clostridium novyi type B alpha-toxoid against challenge with spores in guinea pigs. Journal of Veterinary Medical Science, 60(6), 681-685. [DOI:10.1292/jvms.60.681]
3. Ardehali, M., Darakhshan, H., & Moosawi, M. (1984). Production and standardized of Clostridium oedematiens vaccine in Iran. Archives of Razi Institute, 35, 23-26.
4. Aronoff, D. M. & Kazanjian, P. H., (2018). Historical and contemporary features of infections due to Clostridium Novyi. Anaerobe, 50, 80-84. [DOI:10.1016/j.anaerobe.2017.12.012]
5. Feng, X., He, P., Zeng, C., Li, Y. H., Das, S. K., Li, B., Yang, H. F., & Du, Y. (2021). Novel insights into the role of Clostridium novyi-NT related combination bacteriolytic therapy in solid tumors. Oncology Letter, 21(2), 1-8. [DOI:10.3892/ol.2020.12371]
6. Gord-noshahri, N., Fathi najafi, M., Makhdoumi, A. Majidi, B., & Mehrvarz, M. (2016). Identification and cloning of highly epitopic regions of Clostridium novyi alpha toxi. Turkish Journal of Biology, 40, 1219-1212. [DOI:10.3906/biy-1507-121]
7. Jeong, C. G., Seo, B. J., Nazki, S., Jung, B. K., Khatun, A., Yang, M. S., Kim, S. C., Noh, S. H., Shin, J. H., Kim, B., & Kim, W. I. (2020). Characterization of Clostridium novyi isolated from a sow in a sudden death case in Korea. BMC Veterinary Research, 16(1), 1-8. [DOI:10.1186/s12917-020-02349-9]
8. Marwa, A., Marwa, Y., & Hala ElSawy, A. (2022). Factors affecting on production of Clostridium Novyi type (B) Alpha Toxin. Journal of Applied Veterinary Sciences, 7(2), 53-57.
9. Nyaoke, A. C., Navarro, M. A., Beingesser, J., & Uzal, F. A. (2018). Infectious necrotic hepatitis caused by Clostridium novyi type B in a horse: case report and review of the literature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 30(2), 294-299. [DOI:10.1177/1040638717737125]
10. Orrell, K. E., & Melnyk, R. K. (2021). Large clostridial toxins: Mechanisms and roles in disease. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 85(3), 1-9. [DOI:10.1128/MMBR.00064-21]
11. Saejung, C., Hatai, K., Wada, S., Kurata, O., & Sanoamuang, L. (2011). Clinical observations of black disease in fairy shrimps, Streptocephalus sirindhornae and Branchinella thailandensis, from Thailand and pathogen verification. Journal of Fish Diseases, 34(12), 911-920. [DOI:10.1111/j.1365-2761.2011.01314.x]
12. Sambrook, J. (2012). Molecular Cloning: A laboratory manual. 4th edition, Volume 1-4.
13. Sasaki, Y., Kojima, A., Aoki, H., Ogikubo, Y., Takikawa, N., & Tamura, Y. (2002). Phylogenetic analysis and PCR detection of Clostridium Chauvoei, Clostridium Haemolyticum, Clostridium Novyi types A and B, and Clostridium septicum based on the flagellin gene. Veterinary Microbiology, 86(3), 257-267. [DOI:10.1016/S0378-1135(02)00002-0]
14. Sasaki, Y., Yamamoto, K., Kojima, A., Norimatsu, M. & Tamura, Y. (2000). Rapid identification and differentiation of pathogenic clostridia in gas gangrene by polymerase chain reaction based on the 16S-23S rDNA spacer region. Research in Veterinary Science, 69, 289-294. [DOI:10.1053/rvsc.2000.0431]
15. Uzal, F. A., Navarro, M. A., Li, J., Freedman, J. C., Shrestha, A., & McClane, B. A. (2018). Comparative pathogenesis of enteric clostridial infections in humans and animals. Anaerobe, 53, 11-20. [DOI:10.1016/j.anaerobe.2018.06.002]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
