Research on Animal Production

fa تأثیر پپتیدهای زیست‌فعال مشتق از هیدرولیز پودر خون بر پاسخ‌های ایمنی، وضعیت آنتی‌اکسیدانی و میکروفلور روده در جوجه‌های گوشتی Effect of Bioactive Peptides Derived from Blood Meal Hydrolysate on Immune Responses, Antioxidant Status, and Intestinal Microflora in Broiler Chickens فیزیولوژی فیزیولوژی پژوهشي Research مقدمه و هدف: صنعت تولید طیور در سال‌های اخیر با دو چالش اساسی روبرو بوده است: نخست، افزایش تقاضا برای محصولات بدون آنتی‌بیوتیک به دلیل نگرانی از مقاومت ضدمیکروبی، و دوم، نیاز به بهبود کارایی تولید و سلامت پرندگان بدون استفاده از محرک‌های رشد شیمیایی. در این راستا، پپتیدهای زیست‌فعال (Bioactive peptides) که قطعههای کوتاهی از پروتئین‌ها (معمولاً ۲ تا ۲۰ اسید آمینه) هستند و پس از هیدرولیز آنزیمی آزاد می‌شوند، به عنوان یکی از امیدوارکننده‌ترین جایگزین‌ها معرفی شده‌اند. پودر خون حاصل از کشتارگاه‌ها، یک منبع پروتئینی با ارزش با غلظت بالای اسیدهای آمینه ضروری است، اما مصرف مستقیم آن به دلیل طعم نامطلوب و قابلیت هضم پایین محدود می‌باشد. هیدرولیز آنزیمی پودر خون می‌تواند پروتئین‌های بزرگ را به پپتیدهای کوتاه‌زنجیره با وزن مولکولی پایین تبدیل کند که نه تنها فراهمی زیستی بالاتری دارند، بلکه خواص عملکردی جدیدی مانند تعدیل ایمنی و آنتی‌اکسیدانی نیز کسب می‌کنند. پژوهش حاضر با هدف ارزیابی اثر سطوح مختلف پپتیدهای زیست‌فعال حاصل از هیدرولیز آنزیمی پودر خون (BMP) بر تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل، فراسنجه‌های تنش اکسیداتیو (TAC و MDA) و متابولیکی سرم و همچنین جمعیت دو گروه اصلی باکتریایی ایلئوم (لاکتوباسیلوس و اشریشیا کلی) در جوجه‌های گوشتی انجام شد. مواد و روش‌ها: ابتدا پپتیدهای زیست‌فعال از پودر خون کشتارگاهی با استفاده از هیدرولیز آنزیمی با آنزیم آلکالاز (نسبت آنزیم به سوبسترا یک به بیست، دمای ۵۰ درجه سانتی‌گراد، ۲=pH و زمان دو ساعت) تهیه شدند. سپس هیدرولیز با حرارت غیرفعال و محلول لیوفیلیزه شد. آنالیز توزیع وزن مولکولی با HPLC نشان داد که بیش از ۶۲ درصد پپتیدها در محدوده وزنی ۱۸۰ تا ۵۰۰ دالتون قرار دارند که برای جذب رودهای از طریق انتقال‌دهنده PepT1 و فعالیت‌های زیستی مطلوب است. تعداد ۴۰۰ قطعه جوجه گوشتی یک‌روزه (سویه راس ۳۰۸) در قالب طرح کاملاً تصادفی با ۵ تیمار، ۵ تکرار و ۱۶ پرنده در هر تکرار توزیع شدند. تیمارهای آزمایشی شامل: ۱- جیره پایه بدون افزودنی (شاهد)، ۲- جیره پایه حاوی ۲/۰ درصد BMP، -) جیره حاوی ۴/۰ درصد BMP، ۴- جیره حاوی ۶/۰ درصد BMP، و -) جیره حاوی ۸/۰ درصد BMP بودند. جیره‌ها بر اساس نیازهای راس ۳۰۸ در چهار دوره تغذیه‌ای فرموله شدند. در روز ۳۵ پرورش، از هر تکرار دو پرنده خون‌گیری شد و تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل با آزمون مهار هماگلوتیناسیون (HI) اندازه‌گیری شد. همچنین فراسنجه‌های بیوشیمیایی (گلوکز، کلسترول، تری‌گلیسیرید، پروتئین تام، آلبومین، آنزیم‌های کبدی AST و ALT، HDL و اسید اوریک) و شاخص‌های اکسیداتیو دربرگیرندهی ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل (TAC) با روش FRAP و مالون‌دی‌آلدهید (MDA) با روش تیوباربیتوریک اسید در سرم اندازه‌گیری شدند. در روز ۳۸، محتویات ایلئوم برای شمارش لاکتوباسیلوس‌ها (در محیط MRS Agar بی‌هوازی) و اشریشیا کلی (در محیط Chromogenic Agar هوازی) کشت داده شدند. داده‌ها با نرم‌افزار SAS و رویه GLM در قالب طرح کاملاً تصادفی آنالیز شدند و مقایسه میانگین‌ها با آزمون توکی در سطح ۰۵/۰ انجام گرفت. یافته‌ها: افزودن BMP به طور بسیار معنی‌داری تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل را افزایش داد (۰۰۰۱/۰>P). گروه شاهد کمترین تیتر (۸/۵ log₂) را داشت، در حالی که تیمارهای ۴/۰، ۶/۰ و ۸/۰ درصد BMP به ترتیب تیترهای ۷/۷، ۴/۸ و ۵/۸ log₂ را ایجاد کردند که به طور معنی‌داری بیشتر از شاهد بودند (۰۵/۰>P). بین سه سطح بالاتر تفاوت معنی‌داری وجود نداشت که نشان‌دهنده وجود یک سطح آستانه حدود ۴/۰ درصد برای حداکثر تحریک ایمنی است. سطح سرمی TAC و اسید اوریک با افزایش BMP به طور خطی کاهش یافت (۰۰۰۱/۰>P)، به طوری که کمترین مقادیر در تیمار ۸/۰ درصد BMP ثبت شد (TAC از ۴۸/۲ به ۴۰/۱ میلی‌مول بر لیتر و اسید اوریک از ۴۶/۵ به ۵۴/۲ میلی‌مول بر لیتر). سطح MDA روند کاهشی نشان داد (از ۵۶/۲ به ۹۲/۱ نانومول بر میلی‌لیتر) اما این کاهش معنی‌دار نبود (۱۰۶/۰=P). هیچ یک از فراسنجه‌های متابولیکی دیگر (گلوکز، کلسترول، تری‌گلیسیرید، آنزیم‌های کبدی، آلبومین، پروتئین تام، HDL) تحت تأثیر BMP قرار نگرفتند (۰۵/۰<P). جمعیت لاکتوباسیلوس و اشریشیا کلی ایلئوم نیز تغییر معنی‌داری نشان ندادند (به ترتیب ۱۸۳۴/۰=P و ۸۶۷۰/۰=P). نتیجه‌گیری: پژوهش کنونی به طور جامع نشان داد که پپتیدهای زیست‌فعال حاصل از هیدرولیز آنزیمی پودر خون (BMP) با غلبه پپتیدهای با وزن مولکولی ۱۸۰-۵۰۰ دالتون، دارای اثرات قوی تعدیل‌کننده ایمنی و آنتی‌اکسیدانی در جوجه‌های گوشتی هستند. مکمل‌سازی جیره با BMP در سطوح ۴/۰ تا ۸/۰ درصد به طور معنی‌داری تیتر آنتی‌بادی علیه ویروس نیوکاسل را افزایش داد که نشان‌دهنده بهبود پاسخ به واکسیناسیون است. کاهش همزمان اسید اوریک و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در سرم، همراه با روند کاهشی مالون‌دی‌آلدهید، حاکی از کاهش نیاز به آنتی‌اکسیدان‌های درون‌زا به دلیل کاهش تولید رادیکال‌های آزاد و در نتیجه کاهش تنش اکسیداتیو سیستمیک می‌باشد. مهم آنکه این اثرات بدون ایجاد تغییر معنی‌دار در جمعیت میکروفلور ایلئوم (لاکتوباسیلوس و اشریشیا کلی) و بدون اختلال در فراسنجه‌های متابولیکی پایه و آنزیم‌های کبدی رخ دادند، که نشان می‌دهد مکانیسم اصلی اثر BMP از طریق مسیرهای مستقیم میزبان (و نه از طریق تغییر میکروبیوتا) اعمال می‌شود. مهم آنکه این اثرات بدون ایجاد تغییر معنی‌دار در جمعیت لاکتوباسیلوس و اشریشیا کلی ایلئوم و بدون اختلال در فراسنجه‌های متابولیکی پایه و آنزیم‌های کبدی مشاهده شدند؛ بنابراین، به نظر می‌رسد اثرات BMP لزوماً از طریق تغییر در جمعیت باکتریایی مورد بررسی در ایلئوم اعمال نشده باشد و احتمال مشارکت مکانیسم‌های مستقیم مرتبط با پاسخ ایمنی و وضعیت آنتی‌اکسیدانی میزبان وجود دارد. از منظر کاربردی، BMP می‌تواند به عنوان یک افزودنی خوراک ایمن، مؤثر و پایدار در جیره جوجه‌های گوشتی به ویژه در سیستم‌های تولید عاری از آنتی‌بیوتیک مورد استفاده قرار گیرد تا ضمن کاهش استرس اکسیداتیو، کارایی سیستم ایمنی را افزایش دهد. سطح بهینه بر اساس یافته‌های این مطالعه، ۴/۰ درصد جیره می‌باشد. تحقیقات آتی باید به بررسی مکانیسم‌های مولکولی (مانند بیان ژن‌های سایتوکاین و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مسیر Nrf2) و همچنین ارزیابی اثر BMP در شرایط چالش با پاتوژن‌های واقعی بپردازند.   Introduction and Objective: The poultry industry has faced two major challenges in recent years: first, the increasing demand for antibiotic-free products due to concerns about antimicrobial resistance, and second, the need to improve production efficiency and bird health without the use of chemical growth promoters. In this context, bioactive peptides (short fragments of proteins, typically 2–20 amino acids) released through enzymatic hydrolysis have emerged as one of the most promising alternatives. Blood meal from slaughterhouses is a valuable protein source rich in essential amino acids, but its direct use in poultry diets is limited due to poor palatability and low digestibility. Enzymatic hydrolysis of blood meal can convert large proteins into short-chain, low-molecular-weight peptides, which not only have higher bioavailability but also acquire new functional properties such as immunomodulation and antioxidant activity. The present study aimed to evaluate the effects of different levels of bioactive peptides derived from enzymatic hydrolysis of blood meal (BMP) on antibody titers against Newcastle disease virus, serum oxidative stress parameters (TAC and MDA) and metabolic parameters, as well as the population of two major ileal bacterial groups (Lactobacillus and Escherichia coli) in broiler chickens. Materials and Methods: First, bioactive peptides were prepared from slaughterhouse blood meal using enzymatic hydrolysis with Alcalase (enzyme-to-substrate ratio 1:20, temperature 50°C, pH 8, for 2 hours). The hydrolysate was then heat-inactivated and lyophilized. Molecular weight distribution analysis by HPLC showed that over 62% of the peptides were in the range of 180–500 Daltons, which facilitates intestinal absorption via the PepT1 transporter and may enhance its biological activity. A total of 400 one-day-old broiler chicks (Ross 308) were distributed in a completely randomized design with 5 treatments, 5 replicates, and 16 birds per replicate. Experimental treatments were: 1) basal diet without additive (control), 2) basal diet + 0.2% BMP, 3) basal diet + 0.4% BMP, 4) basal diet + 0.6% BMP, and 5) basal diet + 0.8% BMP. Diets were formulated according to Ross 308 requirements over four feeding periods. On day 35, blood samples were collected from two birds per replicate, and antibody titers against Newcastle disease virus were measured by hemagglutination inhibition (HI) test. Serum biochemical parameters (glucose, cholesterol, triglycerides, total protein, albumin, liver enzymes AST and ALT, HDL, and uric acid) and oxidative stress indices including total antioxidant capacity (TAC) by FRAP method and malondialdehyde (MDA) by thiobarbituric acid method were measured. On day 38, ileal contents were cultured for Lactobacillus counts (on MRS Agar under anaerobic conditions) and Escherichia coli counts (on Chromogenic Agar under aerobic conditions). Data were analyzed using SAS software with the GLM procedure in a completely randomized design, and means were compared by Tukey's test at P < 0.05. Results: BMP supplementation significantly increased antibody titers against Newcastle disease virus (P < 0.0001). The control group had the lowest titer (5.8 log₂), while 0.4%, 0.6%, and 0.8% BMP treatments produced titers of 7.7, 8.4, and 8.5 log₂, respectively, which were significantly higher than the control (P < 0.05). No significant differences were observed among the three higher levels, indicating a threshold level of approximately 0.4% for maximal immune stimulation. Serum TAC and uric acid levels decreased linearly with increasing BMP (P < 0.0001), with the lowest values recorded in the 0.8% BMP treatment (TAC from 2.48 to 1.40 mmol/L, and uric acid from 5.46 to 2.54 mmol/L). MDA levels showed a decreasing trend (from 2.56 to 1.92 nmol/mL) but this reduction was not significant (P = 0.106). None of the other metabolic parameters (glucose, cholesterol, triglycerides, liver enzymes, albumin, total protein, HDL) were affected by BMP (P > 0.05). Ileal populations of Lactobacillus and Escherichia coli also did not change significantly (P = 0.1834 and P = 0.8670, respectively), although numerically Lactobacillus increased in BMP treatments. Conclusion: The present study comprehensively demonstrated that bioactive peptides derived from enzymatic hydrolysis of blood meal (BMP), with a predominance of peptides in the 180–500 Dalton molecular weight range, possess strong immunomodulatory and antioxidant effects in broiler chickens. Dietary supplementation with BMP at levels of 0.4% to 0.8% significantly increased antibody titers against Newcastle disease virus, indicating improved vaccine response. The decreases in serum uric acid and total antioxidant capacity, along with a downward trend in malondialdehyde, suggest alterations in systemic oxidative status rather than a definitive reduction in oxidative stress. Importantly, these effects occurred without significant changes in ileal microflora populations (Lactobacillus and Escherichia coli) and without disturbing basal metabolic parameters or liver enzymes, indicating that the main mechanism of BMP action is through direct host pathways (rather than through microbiota modulation). Importantly, these effects were observed without significant changes in the populations of ileal Lactobacillus and Escherichia coli and without disruption of basic metabolic parameters or liver enzyme activities. Therefore, the effects of BMP do not appear to be necessarily mediated through alterations in the bacterial populations examined in the ileum, suggesting that direct mechanisms involving host immune responses and antioxidant status may also contribute to the observed effects.From a practical perspective, BMP can be used as a safe, effective, and sustainable feed additive in broiler diets, particularly in antibiotic-free production systems, to reduce oxidative stress and enhance immune system efficiency. The optimal level based on the findings of this study is 0.4% of the diet. Future research should investigate molecular mechanisms (such as gene expression of cytokines and antioxidant enzymes via the Nrf2 pathway) as well as evaluate the effect of BMP under real pathogen challenge conditions.   پپتید زیست‌فعال, هیدرولیز پودر خون, ایمنی هومورال, ظرفیت آنتی‌اکسیدانی, میکروفلور ایلئوم Antioxidant capacity, Bioactive peptide, Blood meal hydrolysate, Humoral immunity, Ileal microflora. 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-96-10&slc_lang=fa&sid=1 Tohid Mokarrami توحید مکرمی tohid_mokarrami@yahoo.com 100319475328460027198 100319475328460027198 No Bahman Navidshad بهمن نویدشاد bnavidshad@guilan.ac.ir 100319475328460027199 100319475328460027199 Yes Sadegh Karimzadeh صادق کریم زاده sadegh_karimzadeh@yahoo.com 100319475328460027200 100319475328460027200 No Ali Kalantari Hesari علی کلانتری حصاری kalantari.ali67@gmail.com 100319475328460027201 100319475328460027201 No Farzad Mirzaei Aghjehgheshlagh فرزاد میزائی آقجه قشلاق f_mirzaei@uma.ac.ir 100319475328460027202 100319475328460027202 No