Research on Animal Production

fa تحلیل یکپارچه شبکه‌ی تنظیمی miRNA-ژن در بافت‌های مغز و ریه مرغ در طول عفونت آنفلوانزای پرندگان H5N3 Integrative Analysis of miRNA-Gene Regulatory Network in Chicken Brain and Lung Tissues During H5N3 Avian Influenza Infection ژنتیک و اصلاح نژاد دام ژنتیک و اصلاح نژاد دام پژوهشي Research مقدمه و هدف:  برخلاف تمرکز عمده پژوهش‌ها بر سویه‌های پاتوژن بالای آنفلوانزای پرندگان نظیر H5N1 و H5N8، زیرگروه H5N3 به دلیل ویژگی‌های منحصربه‌فردی از جمله پتانسیل بالای سازگاری، پاتوژنیسیته متوسط تا شدید در میزبان‌های پرنده و خطر بالقوه عبور از سد گونه‌ای، یک اولویت پژوهشی محسوب می‌شود. از این رو، تحلیل بیماری‌زایی این ویروس بدون بررسی جامع بافت‌های حیاتی‌ای چون ریه (محل تکثیر اولیه) و مغز (هدف تهاجم نوروتروپیک) ناقص خواهد بود. ریه‌ها و مغز دو بافت حیاتی در بررسی پاتوژنز آنفولانزا می&lrm;باشند. ریه‌ها به عنوان محل اصلی ورود ویروس و فعال شدن ایمنی ذاتی عمل می‌کنند؛ در حالی که گسترش ویروس به مغز، نشان دهنده انتشار سیستمیک و نوروتروپیسم است که منجر به پیامدهای شدیدی مانند اختلالات عصبی، فلج و مرگ ناگهانی در طیور می‌شود. در حالی که تحقیقات گسترده‌ای در مورد پاتوژنز آنفولانزای مرغی در سطوح هیستوپاتولوژیک و ایمونولوژیک انجام شده است، تحقیقات مبتنی بر داده‌های مولکولی با توان عملیاتی بالا، مانند ترانسکریپتومیکس، در طیور، به ویژه در زمینه‌های تحقیقاتی ایران، نسبتاً محدود است. شناسایی ژن‌های کلیدی مرکزی و عناصر تنظیمی غیرکدکننده مانند میکروRNAها (miRNAها) بینش مهمی در مورد چگونگی سازماندهی مجدد چشم‌انداز مولکولی میزبان هنگام مواجهه با یک عامل بیماری‌زا ارائه می‌دهد. در این زمینه، مطالعه حاضر با هدف ساخت شبکه‌ی تنظیمی ژن بر اساس پروفایل‌های بیان ژن افتراقی از بافت‌های مغز و ریه جوجه‌های آلوده به دو سویه ویروس نوترکیب H5N3، یعنی rH5N3 Ori  و rH5N3 P6، انجام شد. با به‌کارگیری رویکردهای پیشرفته بیوانفورماتیک، ما به دنبال شناسایی ژن‌های کلیدی، miRNAهای تنظیمی و مسیرهای بیولوژیکی بودیم که نقش‌های محوری در مکانیسم‌های دفاعی میزبان و پیشرفت بیماری ایفا می‌کنند. مواد و روش&lrm;ها: بازیابی و تجزیه و تحلیل داده‌ها با دریافت داده‌های ریزآرایه DNA از پایگاه داده عمومی (GEO ) و با شماره دسترسی GSE96837  آغاز شد، که شامل پروفایل‌های رونویسی از بافت‌های مغز و ریه مرغ‌هایی بود که به صورت تجربی با ویروس H5N3 آلوده شده بودند و به همراه آن، نمونه‌های شاهد از پرندگان غیرآلوده به عنوان پایه استفاده می‌شدند. پیش‌پردازش و نرمال‌سازی داده‌ها در R با استفاده از بسته limma انجام شد و بیان افتراقی ژن از طریق آزمون t تعدیل‌شده تعیین شد و ژن‌هایی با مقدار p تعدیل‌شده کمتر از 05/0 و تغییر مطلق لگاریتمی 2 بزرگتر از 1 به عنوان معنی‌دار در نظر گرفته شدند. تغییرات رونویسی سراسری با استفاده از نمودارهای آتشفشانی و نقشه‌های حرارتی تجسم شدند. برای بررسی شبکه‌های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI)، ژن‌های با بیان متفاوت (DEGs) با آستانه اطمینان بالای 7/0 در پایگاه داده&lrm;ای String (نسخه 5/11) بارگذاری شدند و شبکه‌های حاصل برای تجسم بهCytoscape  (نسخه 9/3) منتقل شدند. سپس ژن‌های هاب بر اساس توپولوژی شبکه و معیارهایی مانند مرکزیت درجه و مرکزیت بینابینی شناسایی شدند. برای تفسیر عملکردی، آنالیزهای غنی‌سازی با استفاده از g:Profiler و KEGG (دایره‌المعارف ژن‌ها و ژنوم‌های Kyoto)، با تأکید بر مسیرهای مرتبط با ایمنی، سنتز پروتئین و کنترل کیفیت RNA انجام شد. یافته&lrm;ها: مشاهده شد که بیماری با هر دو سویه rH5N3 Ori و rH5N3 P6 باعث برنامه‌ریزی مجدد قابل توجهی در بیان ژن میزبان در بافت‌های مورد بررسی شد. ریه‌ها پاسخ ایمنی شدیدتری نشان دادند، در حالی که مغز تغییرات گسترده‌تری در مسیرهای متابولیکی و شبکه‌های تنش عصبی نشان داد. در مجموع، ۱۴۸۰ DEGs  در ریه‌ها در مقایسه با ۹۳۶ ژن در مغز شناسایی شد که تفاوت‌های مختص بافتی قابل&lrm;توجه در پاسخ میزبان را برجسته می‌کند. تجزیه و تحلیل بیشتر شبکه، ۱۸ ژن هاب با اتصال بالا در شبکه‌های برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI) را شناسایی کرد. نکته قابل توجه این است که اکثر این ژن‌های هاب، پروتئین‌های ریبوزومی، از جمله RPL21، RPL31 و RPS28 بودند که نشان می‌دهد بیماری آنفولانزا به شدت بر ماشین ترجمه میزبان تأثیر می‌گذارد. اجزای هاب اضافی مانند EEF1A1 و EIF3F، که بازیگران کلیدی در طویل شدن و شروع ترجمه هستند، این ایده را تقویت کردند که اختلال در مسیرهای سنتز پروتئین برای بقا و تکثیر ویروس ضروری است. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی با استفاده از مسیرهای KEGG، پنج مسیر مولکولی اصلی تحت تأثیر بیماری را برجسته کرد: بیوژنز ریبوزوم و هیدرولیز GTP، هدف قرار دادن پروتئین موجود بر غشاها، تجزیه mRNA به واسطه جهش بی‌معنی (NMD)، پیام&lrm;رسانی ایمنی ذاتی (به ویژه پاسخ اینترفرون) و تنظیم آپوپتوز. در بافت‌های ریه، در طی غنی‌سازی فرآیندهای مرتبط با ایمنی مانند پیام&lrm;رسانی گیرنده شبه RIG-I و تعاملات واسطه‌گری‌شده با سیتوکین غالب بود، در حالی که مغز تغییرات قوی‌تری را در سطوح کنترل کیفی RNA، فعالیت میتوکندری و تنظیم مرگ خود خواسته سلول نشان داد که نشان‌دهنده پاسخ‌های تنش نورودژنراتیو در مغز است. در سطح بافت، DEGهای ریه مانند IFIT5 و MX1 مطابق با دفاع ضد ویروسی تحریک‌شده با اینترفرون، افزایش بیان زیادی را نشان دادند؛ در حالی که کاهش بیان ژن ریبوزومی در بافت مغزی نشان داده شد که خود ممکن است به عنوان یک سازوکار محافظتی برای محدود کردن تولید پروتئین ویروسی عمل کند. نتیجه‌گیری: تحلیل شبکه، ژن‌های پروتئین ریبوزومی را به عنوان تنظیم‌کننده‌های مرکزی نشان داد و نقش ماشین ترجمه میزبان، به عنوان هدف کلیدی تداخل و دستکاری ویروسی در طول بیماری را برجسته کرد. علاوه بر این، شناسایی miRNAهای جدید مرتبط با عفونت H5N3 فرصت‌های امیدوارکننده‌ای را برای توسعه نشانگرهای زیستی تشخیصی و درمان‌های ضد ویروسی بالقوه فراهم می‌کند. این یافته‌ها بر ضرورت بررسی بافت‌های گوناگون در پژوهش‌های مربوط به بیماری تأکید می‌کنند، زیرا تمرکز صرف بر یک اندام ممکن است درک ناقصی از پیشرفت بیماری و تعاملات میزبان-پاتوژن ارائه دهد. این پژوهش با به‌کارگیری پلتفرم‌های بیوانفورماتیک یکپارچه مانند STRING، Cytoscape و تجزیه و تحلیل مسیر KEGG، چارچوبی را ایجاد نمود که می‌تواند به سایر عفونت‌های ویروسی در طیور تعمیم داده شود. نکته مهم این است که بینش‌های به‌دست‌آمده در اینجا، می&lrm;توانند به طور ‌ویژه&lrm;ای در هدایت راهبرد‌های بهبود ژنتیکی، با هدف تولید پرندگانی با مقاومت بیشتر در برابر بیماری، ارزش عملی داشته باشند. مسیرهای آینده باید شامل اعتبارسنجی تجربی ژن‌های هاب شناسایی‌شده و miRNAها از طریق تکنیک‌هایی مانند qRT-PCR و خاموش‌سازی ژن عملکردی، و همچنین ادغام تجزیه و تحلیل‌های پروتئومیکس و متابولومیکس با ترانسکریپتومیکس برای دستیابی به درک جامع‌تری از دینامیک میزبان-ویروس باشد. در نهایت، این مطالعه دانش ارزشمندی را در جهت محافظت از سلامت طیور و تقویت امنیت غذایی در مواجهه با تهدیدات مداوم آنفولانزای مرغی ارائه می‌دهد. Background: Despite the extensive focus on HPAI strains like H5N1 and H5N8, the H5N3 subtype represents a compelling research priority owing to its rapid adaptability, moderate-to-severe pathogenicity in avian species, and zoonotic threat. A thorough understanding of its pathogenesis is therefore contingent upon a comprehensive examination of key target organs, specifically the lungs (primary replication site) and the brain (site of neurotropic involvement). The lungs and the brain are two critical tissues in influenza pathogenesis. The lungs serve as the main site of viral entry and activation of innate immunity, while the virus’s spread to the brain indicates systemic dissemination and neurotropism, leading to severe outcomes such as neurological disorders, paralysis, and sudden death in poultry. While extensive research has been conducted on the pathogenesis of avian influenza at the histopathological and immunological levels, investigations based on high-throughput molecular data, such as transcriptomics, are relatively limited in poultry, particularly in Iranian research contexts. Identifying key hub genes and non-coding regulatory elements such as microRNAs (miRNAs) provides important insight into how the host reorganizes its molecular landscape when challenged by a pathogen. In this context, the present study was undertaken to construct gene regulatory networks based on differential gene expression profiles from the brain and lung tissues of chickens infected with two strains of recombinant H5N3 virus, namely rH5N3 Ori and rH5N3 P6. By applying advanced bioinformatics approaches, we sought to identify key genes, regulatory miRNAs, and biological pathways that play central roles in host defense mechanisms and the progression of disease. Methods: Data retrieval and analysis began with obtaining DNA microarray data from the publicly available GEO database (accession number: GSE96837), which included transcriptional profiles from brain and lung tissues of chickens experimentally infected with the H5N3 virus, along with control samples from uninfected birds used as baselines. Preprocessing and normalization of the data were conducted in R using the limma package, and differential gene expression was determined through a moderated t-test, considering genes with an adjusted p-value less than 0.05 and an absolute log2 fold change greater than 1 as significant. Global transcriptional changes were visualized using volcano plots and heatmaps. To explore protein-protein interaction (PPI) networks, the differentially expressed genes (DEGs) were uploaded into the STRING database (version 11.5) with a high-confidence threshold of 0.7, and the resulting networks were exported into Cytoscape (version 3.9) for visualization. Hub genes were then identified based on network topology, metrics such as degree centrality and betweenness centrality. For functional interpretation, enrichment analyses were performed using g: Profiler and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), with emphasis on pathways associated with immunity, protein synthesis, and RNA quality control. Results: It was observed that infection with both rH5N3 Ori and rH5N3 P6 strains caused a substantial reprogramming of host gene expression in the examined tissues. The lungs mounted a more pronounced immune-related response, whereas the brain displayed broader alterations in metabolic pathways and neuronal stress networks. In total, 1480 differentially expressed genes (DEGs) were identified in the lungs compared to 936 in the brain, underscoring significant tissue-specific differences in the host response. Further network analysis identified 18 hub genes with high connectivity within the protein-protein interaction (PPI) networks. Remarkably, the majority of these hub genes were ribosomal proteins, including RPL21, RPL31, and RPS28, suggesting that influenza infection strongly impacts host translation machinery. Additional hub components such as EEF1A1 and EIF3F, key players in translation elongation and initiation, reinforced the idea that disruption of protein synthesis pathways is central to viral survival and replication. Enrichment analysis using KEGG pathways highlighted five major molecular routes influenced by infection: ribosome biogenesis and GTP hydrolysis, protein targeting to membranes, nonsense-mediated mRNA decay (NMD), innate immune signaling (particularly interferon response), and apoptosis regulation. In lung tissues, enrichment was dominated by immune-related processes such as RIG-I-like receptor signaling and cytokine-mediated interactions, while the brain showed stronger alterations in RNA quality control, mitochondrial activity, and apoptosis regulation, indicating neurodegenerative stress responses. At the tissue level, lung DEGs such as IFIT5 and MX1 demonstrated strong upregulation consistent with interferon-stimulated antiviral defense, whereas the brain showed reduced ribosomal gene expression, implying a translational arrest that may act as a protective mechanism to limit viral protein production. Conclusion: Network analysis pointed to ribosomal protein genes as central regulators, underscoring the role of host translational machinery as a key target of viral interference and manipulation during infection. Moreover, the identification of novel miRNAs associated with H5N3 infection opens promising opportunities for the development of diagnostic biomarkers and potential antiviral therapies. These findings emphasize the necessity of examining multiple tissues in infection studies, as focusing solely on one organ may provide an incomplete understanding of disease progression and host-pathogen interactions. By employing integrated bioinformatics platforms such as STRING, Cytoscape, and KEGG pathway analysis, this research establishes a framework that can be extended to other viral infections in poultry. Importantly, the insights derived here hold practical value for the poultry sector, particularly in guiding genetic improvement strategies aimed at producing birds with enhanced disease resistance. Future directions should include experimental validation of the identified hub genes and miRNAs through techniques like qRT-PCR and functional gene silencing, as well as integrating proteomic and metabolomic analyses with transcriptomics to achieve a more comprehensive understanding of host-virus dynamics. Ultimately, this study contributes valuable knowledge toward protecting poultry health and strengthening food security in the face of ongoing avian influenza threats. شبکه‌های ژنی, بیان ژنی, آنفلوانزای H5N3, miRNA, پروتئین‌های ریبوزومی, تعاملات میزبان-پاتوژن Gene networks, Gene expression, H5N3 influenza, miRNA, Ribosomal proteins, Host-pathogen interactions 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-541-4&slc_lang=fa&sid=1 Mostafa Ghaderi-Zefrehei مصطفی قادری زفره ای mghaderi@yu.ac.ir 100319475328460026457 100319475328460026457 Yes Yasouj University دانشگاه یاسوج Farhad Samadian فرهاد صمدیان f.samadian@yu.ac.ir 100319475328460026458 100319475328460026458 No Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Yasouj University, Yasouj, Iran دانشگاه یاسوج Salar Sabouri سالار صبوری sabourisalar4@gmail.com 100319475328460026459 100319475328460026459 No Tabriz University دانشگاه تبریز Soheil Sabouri سهیل صبوری sabourisoheil55@gmail.com 100319475328460026460 100319475328460026460 No Tabriz University دانشگاه تبریز Sholeh Ghorbani شعله قربانی sholehghorbani@gmail.com 100319475328460026461 100319475328460026461 No Education and Extension Organization سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی