Research on Animal Production

fa تحلیل غنی‌سازی عملکردی ژنی بر پایه‌ی مطالعه ارتباط ژنومی برای صفات نرخ رشد در یاک Functional Gene Enrichment Analysis Based on GWAS of Growth Rate Traits in Yak ژنتیک و اصلاح نژاد دام ژنتیک و اصلاح نژاد دام پژوهشي Research مقدمه و هدف:  صفات رشد از شاخص‌های اقتصادی مهم در تولید دام محسوب می‌شوند و به طور مستقیم با تولید گوشت، بهره‌وری منابع و سودآوری مرتبط هستند. در یاک که به نواحی مرتفع سازگار شده است، عملکرد رشد معمولاً تحت تأثیر شرایط سخت محیطی است. درک پایه‌های ژنتیکی صفات رشد می‌تواند بینشی فراهم کند که به اصلاح‌نژاد مولکولی و افزایش بهره ژنتیکی کمک نماید.  مطالعات ارتباط ژنومی (GWAS) ابزار مهمی برای شناسایی نواحی ژنومی مؤثر بر صفات اقتصادی دام و بهبود برنامه‌های اصلاح‌نژاد ژنومی هستند. با وجود این، این روش محدودیت‌هایی دارد؛ چرا که هر نشانگر به‌تنهایی آزمون می‌شود و آستانه‌های آماری سخت‌گیرانه باعث می‌شود بسیاری از واریانت‌های علّی، به‌ویژه در صفات چندژنی، شناسایی نشوند. در تراشه‌های با تراکم بالای SNP نیز ممکن است اثر یک ژن میان چندین نشانگر توزیع شود و هیچ‌کدام به آستانه معنی‌داری نرسند. همچنین، پیوستگی ژنتیکی وسیع در دام‌ها، تعیین دقیق جهش‌های سببی را دشوارتر می‌کند. افزون بر این، GWAS تعامل واقعی ژن‌ها در مسیرهای زیستی و شبکه‌های عملکردی را نادیده می‌گیرد و به دلیل ماهیت دوآللی SNPها، قادر به نمایش کامل اثر QTLهای چندآللی نیست. برای رفع این محدودیت‌ها، پیشنهاد شده است که تحلیل‌ها از سطح SNP فراتر رفته و به سطح ژن یا مجموعه ژنی گسترش یابد. در این روش، ژن‌هایی که حامل SNPهای معنادار هستند و در یک مسیر زیستی یا فرایند مشترک قرار دارند، از نظر غنای آماری بررسی می‌شوند. این رویکرد می‌تواند توان شناسایی واریانت‌های علّی را افزایش داده و درک عمیق‌تری از پایه ژنتیکی صفات کمی فراهم سازد. بر همین اساس، مطالعه حاضر با استفاده از داده‌های ژنومی منتشرشده، به تحلیل عملکردی ژن‌های کاندید مؤثر بر رشد در یاک و تفسیر بیولوژیکی نتایج GWAS پرداخت تا راهکارهای کاربردی‌تری برای اصلاح‌نژاد این گونه ارائه شود. هدف این پژوهش شناسایی جایگاه‌های ژنومی مرتبط با رشد پس از از شیرگیری در یاک‌های نژاد آشیدان با استفاده از مطالعه ارتباط کل ژنوم (GWAS) و بررسی مسیرهای عملکردی از طریق تحلیل غنای ژنی بود. مواد و روش‌ها:  در این مطالعه از داده‌های منتشرشده مربوط به ۳۵۴ رأس یاک ماده آشیدان استفاده شد. ژنوتیپ‌گیری با استفاده از تراشه Illumina BovineHD BeadChip شامل 777,962 نشانگر SNP انجام شده بود. کنترل کیفیت داده‌ها در نرم‌افزار PLINK صورت گرفت. به این صورت که، نشانگرهایی با بیش از ۰٫۰۵ از دست‌رفته، فراوانی آلل فرعی (MAF) کمتر از ۰٫۰۵، یا انحراف معنی‌دار از تعادل هاردی–واینبرگ (p<1e-6)  و افراد با بیش از ۰٫۰۵ از دست‌رفته حذف شدند. برای برآورد ژنوتیپ‌های مفقود از الگوریتم LD-kNNi در نرم‌افزار TASSEL استفاده شد. ساختار جمعیت با تحلیل مؤلفه‌های اصلی در نرم‌افزار TASSEL (PCA) بررسی شد و پنج مؤلفه نخست به‌عنوان متغیر کمکی در مدل خطی مختلط لحاظ شدند. تحلیل GWAS با مدل خطی مختلط (MLM) در TASSEL v5.2 انجام شد که ماتریس خویشاوندی (K) و ساختار جمعیتی  (Q) را در نظر می‌گرفت. به‌منظور شناسایی مسیرهای بیولوژیکی مرتبط با نرخ رشد در یاک، اجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن (GO) نیز انجام شد. در این بخش، از تمامی ژن‌هایی که در فاصله ±15kb  از SNPهای دارای p-value < 0.05 قرار داشتند  استفاده شد. استخراج موقعیت ژنی این SNPها نیز با مراجعه به نسخه ژنومی Bos taurus UMD3.1  انجام گرفت. فهرست ژن‌های شناسایی‌شده به ابزار آنلاین g:Profiler  منتقل شد و تحلیل غنی‌سازی در سه دسته‌ هستی شناسی ژن شامل فرایندهای زیستی(BP)، عملکرد مولکولی (MF)، و جزء سلولی(CC)  و نیز مسیرهای KEGG  صورت گرفت. سطوح معنی‌داری مسیرها بر اساس p-value < 0.05  تصحیح شده گزارش شدند. یافته‌ها: با کنترل کیفیت داده‌های ژنومی با استفاده از نرم افزار PLINK، یک نمونه به‌دلیل کیفیت پایین ژنوتایپ حذف گردید و در نهایت ۳۵۳ فرد باقی ماندند. از مجموع نشانگرها، ۲۵۴۰ SNP به دلیل درصد بالای داده‌های گمشده، ۶۵۱۲۲ SNP به دلیل MAF پایین، و ۴ نشانگر به دلیل انحراف از تعادل هاردی-واینبرگ حذف شدند. بنابراین، در نهایت ۳۲۵۷۳ نشانگر با کیفیت بالا برای تحلیل‌های بعدی باقی ماند. میانگین نرخ ژنوتایپ در افراد باقی‌مانده برابر با 6/99 درصد بود. برای صفت اول (نرخ رشد از ۶ تا ۱۲ ماهگی) هیچ ناحیه ژنومی در سطح معنی‌داری ژنومی (p < 1.5×10⁻⁶) شناسایی نشد. در مقابل، برای صفت دوم (نرخ رشد از ۶ تا ۳۰ ماهگی) تعداد 22  SNPهای معنی‌دار  (p < 1.5×10⁻⁶) روی کروموزوم ۱ شناسایی گردیدند. قوی‌ترین سیگنال‌ها در بازه 8/1 تا 1/2 مگاباز ظاهر شدند. در این ناحیه، ژن C1H21orf62  بعنوان کاندید اصلی معرفی شد که در دربرگیرنده چندین SNP معنی‌دار بود. علاوه بر این، در بخش پایین‌دست همین منطقه، ژن‌های GCFC  و SYNJ1  نیز شناسایی شدند. برای صفت سوم (نرخ رشد از ۱۲ تا ۳۰ ماهگی) نیز یک ناحیه بسیار معنی‌دار بر روی کروموزوم ۱ آشکار شد. تمامی SNPهای معنی‌دار در این صفت در بازه مشابهی با صفت دوم قرار داشتند و همگی با ژن C1H21orf62  در ارتباط بودند. تحلیل عملکرد مولکولی نشان داد که ژن‌های شناسایی‌شده در ارتباط با رشد یاک به‌طور معنی‌داری در دسته‌های متعددی غنی شدند. مهم‌ترین این دسته‌ها در سطح عملکرد مولکولی  شامل اتصال یون‌ها (GO:0043167)، اتصال مولکول‌های کوچک (GO:0036094)، فعالیت ناقل غشایی (GO:0022857)، فعالیت موتور سیتواسکلتی (GO:0003774)، فعالیت هیدرولازی (GO:0016787) بودنذ. در سطح فرایندهای زیستی، ژن‌های کاندید رشد در گروه‌های اصلی از جمله چسبندگی سلولی (GO:0007155)، انتقال یون‌های ساده (GO:0006811)، رشد و تکوین سیستم عصبی (GO:0007399)، غنی بودند. در بخش جزء سلولی، ژن‌ها به‌طور برجسته‌ای در پیوندگاه‌های سلولی (GO:0030054)، پیرامون سلول (GO:0071944), و غشای پلاسمایی (GO:0005886), غنی شدند. بررسی مسیرهای زیستی در KEGG  نشان داد که ژن‌های شناسایی‌شده به‌طور عمده در مسیرهای پروتئین‌های حرکتی  (KEGG:04814)مشارکت دارند. نتیجه‌گیری: این مطالعه SNPها و نواحی ژنومی معناداری را در ارتباط با صفات رشد پس از از شیرگیری در یاک آشی‌دان شناسایی کرد. در حالی که رشد اولیه (۶–۱۲ ماه) فاقد ارتباط ژنومی معنادار بود، بازه‌های طولانی‌تر (۶–۳۰ و ۱۲–۳۰ ماه) چندین جایگاه و مسیر زیستی کلیدی را آشکار ساخت. ترکیب ژنوتیپ‌گیری با تراکم بالا، برآورد داده‌های مفقود، مدل‌های خطی مختلط و تحلیل غنای ژنی، تصویری جامع از معماری ژنتیکی رشد در یاک فراهم کرد. این یافته‌ها پایه ارزشمندی برای مطالعات مولکولی آینده بوده و نشانگرهای عملی برای برنامه‌های اصلاح‌نژادی و انتخاب در یاک ارائه می‌دهند.   Introduction and Objective: Growth traits are among the most important economic indicators in livestock production, directly linked to meat yield, resource efficiency, and profitability. In yak, which is well adapted to high-altitude regions, growth performance is often constrained by harsh environmental conditions. Understanding the genetic basis of growth traits can provide insights that contribute to molecular breeding and genetic improvement. Genome-wide association studies (GWAS) are valuable tools for identifying genomic regions influencing economically important traits in livestock and for advancing genomic breeding programs. However, GWAS has several limitations: markers are tested individually, and stringent statistical thresholds often result in many causal variants being undetected, particularly for polygenic traits. On high-density SNP chips, the effect of a gene may be distributed across multiple markers, preventing any from reaching genome-wide significance. Moreover, extensive linkage disequilibrium in livestock populations complicates the precise identification of causal mutations. Additionally, GWAS does not capture the real interactions among genes within biological pathways or functional networks, and due to the biallelic nature of SNPs, it cannot fully represent the effects of multi-allelic QTLs. To overcome these challenges, it has been suggested that analyses should extend beyond SNP-level to gene-level or gene-set approaches. In this framework, genes harboring significant SNPs that participate in common pathways or biological processes are tested for statistical enrichment. Such approaches enhance the power to detect causal variants and provide deeper insights into the genetic architecture of complex traits. Based on this rationale, the present study utilized publicly available genomic data to functionally analyze candidate genes associated with growth traits in yak and to biologically interpret GWAS results in order to provide more practical implications for breeding programs. The main objective was to identify genomic loci associated with post-weaning growth in Ashidan yaks through GWAS and to investigate functional pathways by means of gene enrichment analysis. Materials and Methods: This study used previously published data from 354 female Ashidan yaks (Jia et al., 2020). Genotyping had been performed using the Illumina BovineHD BeadChip, which included 777,962 SNP markers. Data quality control was conducted in PLINK. SNPs with more than 0.05 missing data, minor allele frequency (MAF) < 0.05, or significant deviation from Hardy–Weinberg equilibrium (p < 10-6) were excluded, as were individuals with >0.05 missing data. Missing genotypes were imputed using the LD-kNNi algorithm in TASSEL. Population structure was evaluated by principal component analysis (PCA), and the first five PCs were included as covariates in the mixed linear model. GWAS was carried out in TASSEL v5.2 using a mixed linear model (MLM) incorporating both a kinship matrix (K) and population structure (Q). To identify biological pathways associated with growth traits, Gene Ontology (GO) analysis was performed. All genes located within ±15 kb of SNPs with p-value < 0.05 were extracted based on the Bos taurus UMD3.1 genome assembly. These candidate genes were then submitted to the g:Profiler tool for enrichment analysis in three GO domains: Biological Process (BP), Molecular Function (MF), and Cellular Component (CC), as well as in KEGG pathways. Significance thresholds were set at corrected p-value < 0.05. Results: Following quality control, one individual was excluded due to poor genotyping quality, leaving 353 yaks for further analysis. From the initial SNP dataset, 2,540 SNPs were removed due to high missingness, 65,122 SNPs were removed due to low MAF, and four SNPs deviating from Hardy–Weinberg equilibrium were excluded. Ultimately, 32,573 high-quality SNPs remained. The average genotyping rate of the retained individuals was 99.6%. For the first trait (average daily gain from 6 to 12 months), no genomic regions reached genome-wide significance (p < 1.5 × 10⁻⁶). In contrast, for the second trait (average daily gain from 6 to 30 months), 22 significant SNPs (p < 1.5 × 10⁻⁶) were detected on chromosome 1, with the strongest signals appearing between 1.8 and 2.1 Mb. Within this region, the gene C1H21orf62 emerged as the main candidate, harboring several significant SNPs. Downstream of this region, additional candidate genes such as GCFC and SYNJ1 were also identified. For the third trait (average daily gain from 12 to 30 months), a highly significant region was again detected on chromosome 1, overlapping with the same region as the second trait, with all significant SNPs closely associated with the C1H21orf62 gene. Functional enrichment analysis further revealed that the identified growth-associated genes were significantly enriched in multiple categories. At the molecular function level, significant enrichment was observed for ion binding (GO:0043167), small molecule binding (GO:0036094), transmembrane transporter activity (GO:0022857), cytoskeletal motor activity (GO:0003774), and hydrolase activity (GO:0016787). At the biological process level, candidate genes were enriched in cell adhesion (GO:0007155), monoatomic ion transport (GO:0006811), and nervous system development (GO:0007399). At the cellular component level, genes were predominantly enriched in cell junctions (GO:0030054), cell periphery (GO:0071944), and plasma membrane (GO:0005886). KEGG pathway analysis revealed that the identified genes were mainly involved in motor protein-related pathways (KEGG:04814), emphasizing the regulatory complexity of growth-related genes. Conclusion: This study successfully identified significant SNPs and genomic regions associated with post-weaning growth traits in Ashidan yaks. While no significant associations were detected for early growth (6–12 months), extended growth intervals (6–30 and 12–30 months) revealed several key loci and biologically relevant pathways. The integration of high-density genotyping, genotype imputation, mixed linear modeling, and gene enrichment analysis provided a comprehensive overview of the genetic architecture underlying growth in yaks. These findings lay a valuable foundation for future molecular studies and provide practical markers for use in yak breeding and selection programs.   یاک, GWAS, صفات رشد, مدل خطی ترکیبی, آنالیز غنی‌سازی, TASSEL, SNP Yak, GWAS, growth traits, TASSEL, SNP, mixed linear model, gene enrichment, LD-kNNi 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-452-7&slc_lang=fa&sid=1 Shahrokh Jalali شاهرخ جلالی pjalali46@yahoo.com 100319475328460026380 100319475328460026380 Yes Department of Animal Science and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU), Sari, Iran. گروه علوم دامی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری Mohsen Gholizadeh محسن قلی زاده m.gholizadeh@sanru.ac.ir 100319475328460026381 100319475328460026381 No Department of Animal Science and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University (SANRU), Sari, Iran. گروه علوم دامی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری Seyed Mehdi Esmaeili-Fard سید مهدی اسماعیلی فرد mehdi.esmaeilifard@gmail.com 100319475328460026382 100319475328460026382 No Center for immunity and immunotherapy, Seattle children's Research Institute, Seattle, USA. پژوهشگر، مرکز ایمنی و ایمونوتراپی، موسسه تحقیقات کودکان سیاتل، سیاتل، ایالات متحده آمریکا