Research on Animal Production

fa تعیین مناسب‌ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران با استفاده از طیف‌سنجی میکرو رامان Determining the most appropriate time to determine the sex of Iranian native chicken embryos using micro Raman spectroscopy ژنتیک و اصلاح نژاد طیور ژنتیک و اصلاح نژاد طیور پژوهشي Research مقدمه و هدف: در حال حاضر، تعیین جنسیت طیور بر اساس تفاوتهای ظاهری نر و ماده توسط تکنسین های ماهر انجام می شود. این موضوع نیازمند نیروی ماهر است که سبب اتلاف وقت نیز می‌شود. طیف‌سنجی رامان یک تکنیک تحلیلی است که بر اساس پراکندگی نور و اثرات ارتعاشی مولکول‌ها عمل می‌کند و به عنوان ابزاری غیرمخرب برای تحلیل ساختار شیمیایی و شناسایی مواد مختلف شناخته شده است. این روش برای اولین بار توسط فیزیکدان هندی، چاندرا سخار ونکتا رامان، در سال 1930 کشف شد و به خاطر این دستاورد جایزه نوبل را دریافت کرد. در این روش، نمونه‌ها با استفاده از لیزر تحریک می‌شوند و نور پراکنده‌ شده از آنها اطلاعاتی درباره ساختار و ویژگی‌های بیوشیمیایی آنها ارائه می‌دهد. یکی از کاربردهای مهم طیف‌سنجی رامان، تعیین جنسیت جنین جوجه‌ها در تخم‌مرغ است. با توجه به تفاوت‌های بیوشیمیایی میان سلول‌های پرندگان نر و ماده، این تکنیک می‌تواند به شناسایی جنسیت تخم‌مرغ‌ها بر اساس تجزیه و تحلیل سلول‌های خون کمک کند. این موضوع به ویژه در صنعت طیور اهمیت دارد، زیرا جوجه‌های با جنسیت ناخواسته معمولاً پس از جوجه‌ریزی کشته می‌شوند و استفاده از طیف‌سنجی رامان می‌تواند به کاهش این ضایعات اقتصادی و اخلاقی کمک کند. ترکیبات خون جنین جوجه با گذشت زمان، از تولید اولیه گلبول‌های قرمز تا توسعه کامل سیستم خونی تغییرات قابل توجهی را تجربه می‌کند. لذا این مطالعه برای تعیین مناسبترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران از طریق آنالیز خون با استفاده از طیف‌سنجی میکرو رامان UniRAM اجرا شد. مواد و روش‌ها: تخم‌مرغ‌های بارور بهمنظور طی کردن مراحل جنینی به دستگاه جوجهکشی در دمای 8/37 درجه سانتیگراد و رطوبت 53 درصد درون دستگاه جوجه کشی قرار داده شدند. جنینها در سنین 5/3، 5، 8 و 13 روزگی به طور جداگانه با استفاده از دستگاه طیف‌سنجی میکرو رامان  UniRAMبا طول موج 785 نانومتر تحت ارزیابی قرار گرفتند. به منظور نمایش رگ‌های جنینی، یک سیستم دوربین توسعه یافته است که به‌طور خودکار رگ مناسب را شناسایی کرده و تمرکز پرتو لیزر را روی آن متمرکز می‌کند. طیف‌های بهدست ‌آمده از طیفسنج رامان با استفاده از نرم‌افزار Origin رسم شده و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. از جمله شاخصهای اصلی مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل طیف رامان، شدت پیکهای رامانی و نسبت شدت پیکهای غالب بودند. پس از اتمام مراحل آنالیز، به منظور تایید جنسیت جنینها، آنها را از تخم‌مرغ خارج و فرآیند استخراجDNA  با استفاده از کیت استخراج Animal Tissue DNA Isolation ساخت شرکت دنازیست انجام شد. سپس کمیت و کیفیت DNA استخراجشده با استفاده از دستگاه نانودراپ مدل (Thermo Scientific NanoDROP. 2000C، کشور آمریکا) و الکتروفورز ژل مورد بررسی قرار گرفت. ژن اتصال DNA، کروموبوکس هلیکاز 1 (CHD) بهعنوان ژن تعیین جنسیت استفاده شد و آغازگرهای اختصاصی برای آن طراحی شد. به منظور تعیین جنسیت نمونهها با استفاده از آغازگرهای طراحی شده، ابتدا واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) انجام گرفت و در نهایت نتیجه آزمایش روی ژل آگارز دو و نیم درصد مشاهده شد. یافتهها: طبق نتایج این مطالعه، تفاوت‌های معنی‌داری در میانگین شدت فلورسانس بین جنس‌های نر و ماده تخم‌مرغ‌ها مشاهده شد، هرچند که همپوشانی زیادی وجود داشت. یکی از نمودارهای مورد بررسی در این پژوهش نمودار شمعی بود. این نمودار نشان می‌دهد که چگونه پیک‌های غالب در روزهای مختلف جوجه‌کشی برای تخم‌مرغ‌های مورد آزمایش توزیع شده‌اند. همچنین، این نمودار توزیع آماری داده‌ها را نشان می‌دهد که اطلاعاتی در مورد شاخص‌های مرکزی را در بر دارد. در نهایت، بیشترین تفاوت شدت فلورسانس در روز 5/3 جوجه‌کشی ثبت شد، جایی که طیف فلورسانس خون نر و ماده شکل‌های متمایزی را نشان داد. پس از روز 4 جوجهکشی، شدت فلورسانس در جوجه‌های نر بیشتر باقی ماند، اما شکل طیفی به سرعت کاهش یافت و تا روز 5 بهطور کامل از بین رفت. این تفاوت‌ها به دلیل تفاوت در تولید گلبول‌های قرمز و هموگلوبین متفاوت بین دو جنس‌ و تأثیر کروموزوم‌های جنسی بر ساختار گنادها است. تفاوت در مقدار هموگلوبین به تفاوت در اشباع اکسیژن خون نرها و ماده‌ها مرتبط است، بهطوری که خون نر احتمالاً دارای میل اکسیژن بیشتری نسبت به خون ماده است. جوجه‌های نر دارای کروموزوم‌های ZZ و جوجه‌های ماده دارای کروموزوم‌های ZW هستند که این تفاوت در ساختار ژنتیکی منجر به تمایز در ویژگی‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی و تمایز در ساختار گنادها می‌شود. برای تایید نتایج تعیین جنسیت توسط طیف‌سنجی میکرورامان از واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده شد. نتایج الکتروفورز ژل آگاروز، دو باند با طولهای 461 و 322 جفت باز برای جنینهای با جنسیت ماده (ZW) و یک قطعه به طول 461 جفت باز برای جنینهای با جنسیت نر  (ZZ) نشان داد. نتیجهگیری: با توجه به بررسیهای انجام شده در این مطالعه، روز 5/3 انکوباسیون بهعنوان مناسبترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی با استفاده از طیف‌سنجی میکرو رامان شناخته شد. از جمله مزایای روش‌های طیف‌سنجی و فلورسانس شامل دقت زیاد و زمان تحلیل کوتاه است که می‌تواند به توسعه سیستم‌های صنعتی برای تعیین جنسیت تخم‌مرغ‌ها کمک کند. این روش ترکیبی از تکنیک‌های پیشرفته طیف‌سنجی رامان و تجزیه و تحلیل ژنتیکی برای تعیین جنسیت جوجه‌ها در مراحل اولیه جوجه‌کشی را ارائه می‌دهد که می‌تواند بهطور مؤثری در صنعت طیور مورد استفاده قرار گیرد.   Background: Currently, determining the sex of poultry based on the physical differences between males and females is done by skilled technicians. This requires skilled labor and is also time-consuming. Raman spectroscopy is an analytical technique that relies on light scattering and the vibrational effects of molecules. It is recognized as a non-destructive tool for analyzing chemical structures and identifying various substances. This method was first discovered by Indian physicist Chandra Sekhar Venkata Raman in 1930, for which he was awarded the Nobel Prize. In this technique, samples are excited using a laser, and the light that is scattered from them provides valuable information about their structure and biochemical properties. One significant application of Raman spectroscopy is in determining the sex of chicks in eggs. Due to the biochemical differences between the cells of male and female birds, this technique can help identify the gender of eggs through blood cell analysis. This is particularly important in the poultry industry, Because chicks of the unwanted sex are usually killed after hatching., and employing Raman spectroscopy can help reduce this economic and ethical waste. As chick embryos develop, their blood composition undergoes significant changes, starting from the initial production of red blood cells to the full development of their circulatory system. Consequently, this study was conducted to determine the optimal time for identifying the sex of Iranian native chicken embryos through blood analysis using micro-Raman spectroscopy. Methods: Fertilized eggs were incubated at a temperature of 37.8°C and 53% humidity to facilitate embryonic development. Embryos at different ages—3.5, 5, 8, and 13 days—were evaluated separately using a UniRAM Microraman spectrometer with a wavelength of 785 nm. To visualize the embryonic vessels, a specialized camera system was developed that automatically identifies the relevant vessel and focuses the laser beam on it. The spectra obtained from the Raman spectrometer were plotted and analyzed using Origin software, with key indicators such as the intensity of Raman peaks and the intensity ratio of dominant peaks being utilized for analysis. Among the main indicators used to analyze the Raman spectrum were the intensity of the Raman peaks and the intensity ratio of the dominant peaks. After the analysis process was completed, in order to confirm the gender of the embryos, they were removed from the eggs and the DNA extraction process was carried out using the Animal Tissue DNA Isolation kit manufactured by the Denazist The quantity and quality of the extracted DNA were assessed using a NanoDrop device (Thermo Scientific NanoDROP 2000C, USA) and gel electrophoresis. The CHD gene was employed as a sex-determining marker, for which specific primers were designed. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to determine the sex of the samples using these primers, and the results were observed on a two-and-a-half percent agarose gel. Results: The results of this study revealed significant differences in the average fluorescence intensity between male and female eggs, although there was considerable overlap. One of the charts examined in this research was the candlestick chart, this chart shows how the dominant peaks are distributed on different days of incubation for the tested eggs. Also, this chart shows the statistical distribution of the data, which includes information about the central indicators. Finally, this chart also provided a statistical distribution of the data, highlighting central indices. The most pronounced difference in fluorescence intensity was observed on day 3.5 of incubation, where the fluorescence spectra of male and female blood exhibited distinct shapes. After day 4, the fluorescence intensity remained higher in male chicks; however, the spectral shape diminished rapidly and was completely lost by day 5. These variations can be attributed to differences in the production of red blood cells and hemoglobin between the sexes, as well as the influence of sex chromosomes on gonadal structure. The difference in hemoglobin levels is related to the difference in the oxygen saturation of the blood of males and females, so that male blood is likely to have a higher oxygen affinity than female blood. Male chickens possess ZZ chromosomes, while female chickens have ZW chromosomes. This genetic distinction leads to differences in physiological and biochemical characteristics, as well as variations in gonadal structure. Male chickens have ZZ chromosomes and female chickens have ZW chromosomes. This difference in genetic structure leads to differences in physiological and biochemical characteristics and differentiation in the structure of the gonads. Polymerase chain reaction was used to confirm the Raman spectroscopy results. The results of agarose gel electrophoresis showed two bands with lengths of 461 and 322 base pair for female embryos (ZW) and one fragment with a length of 461 base pair for male embryos (ZZ). Conclusion: According to the findings of this study, day 3.5 of incubation was identified as the optimal time for determining the gender of native chicken embryos using micro Raman spectroscopy. This method boasts several advantages, including high accuracy and a short analysis time, which are essential for developing industrial systems aimed at sexing eggs. By combining advanced techniques from Raman spectroscopy with genetic analysis, this approach allows for effective gender determination of chickens in the early stages of hatching, making it particularly beneficial for the poultry industry. تعیین جنسیت, جنین مرغ, طیف سنجی رامان. Sex determination, chicken embryo, Raman spectroscopy. 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1914-2&slc_lang=fa&sid=1 Sepideh Rostami سپیده رستمی s.rostami1585@gmail.com 100319475328460026421 100319475328460026421 No PhD Student of Animal genetic and Breeding, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran دانشجوی دکترای ژنتیک و اصلاح دام و طیور، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان. دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی. ملاثانی. ایران mohammadtaghi beiginassiri محمدتقی بیگی نصیری mt_nassiri@yahoo.com 100319475328460026422 100319475328460026422 Yes Professor, Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Ahvaz, Iran. استاد گروه علوم دامی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان. دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی. اهواز. ایران. Mahmoud Nazari محمود نظری fat_sa_2005@yahoo.com 100319475328460026423 100319475328460026423 No 3. Associate Professor, Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Ahvaz, Iran. 3. دانشیار گروه علوم دامی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان. دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی. اهواز. ایران. Mohsen cheraghizadeh محسن چراغی زاده mcheraghizade@yahoo.com 100319475328460026424 100319475328460026424 No 4. Associate Professor, Advanced Surface Engineering and Nano Materials Research Center Department of Electrical Engineering Ahvaz Branch, IAU, Ahvaz, Iran. 4. استادیار مرکز تحقیقات مهندسی سطح پیشرفته و نانومواد، گروه مهندسی برق، دانشگاه آزاد واحد اهواز. ایران.