Research on Animal Production

fa تعیین مناسب‎ ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران با استفاده از طیف‌سنجی میکرو-رامان Determining the Most Appropriate Time to Determine the Sex of Iranian Native Chicken Embryos Using Micro-Raman Spectroscopy ژنتیک و اصلاح نژاد طیور ژنتیک و اصلاح نژاد طیور پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: در حال حاضر، تعیین جنسیت طیور بر اساس تفاوت &lrm;های ظاهری نر و ماده توسط تکنسین&lrm;های ماهر انجام می &lrm;شود. این موضوع نیازمند نیروی ماهر است که سبب اتلاف &lrm;وقت نیز می‌شود. طیف‌سنجی رامان یک تکنیک تحلیلی است که بر اساس پراکندگی نور و اثرات ارتعاشی مولکول‌ها عمل می‌کند و به &lrm;عنوان ابزاری غیر مخرب برای تحلیل ساختار شیمیایی و شناسایی مواد مختلف شناخته شده&lrm; است. این روش برای اولین &lrm;بار توسط فیزیکدان هندی، چاندرا سخار ونکتا رامان، در سال 1930 کشف شد و به &lrm;خاطر این دستاورد جایزه نوبل را دریافت کرد. در این روش، نمونه‌ها با استفاده از لیزر تحریک می‌شوند و نور پراکنده ‌&lrm;شده از آن&lrm; ها اطلاعاتی را در باره ساختار و ویژگی‌های بیوشیمیایی آن&lrm; ها ارائه می‌دهد. یکی از کاربردهای مهم طیف‌سنجی رامان، تعیین جنسیت جنین جوجه‌ها در تخم&lrm;‌مرغ است. با توجه به تفاوت‌های بیوشیمیایی میان سلول‌های پرندگان نر و ماده، این تکنیک می‌تواند به شناسایی جنسیت تخم‌&lrm;مرغ‌ها بر اساس تجزیه و تحلیل سلول‌های خون کمک کند. این موضوع به &lrm;&lrm;ویژه در صنعت طیور اهمیت دارد، زیرا جوجه‌های با جنسیت ناخواسته معمولاً پس از جوجه‌ریزی کشته می‌شوند و استفاده از طیف‌سنجی رامان می‌تواند به کاهش این ضایعات اقتصادی و اخلاقی کمک کند. ترکیبات خون جنین جوجه با گذشت زمان، از تولید اولیه گلبول‌های قرمز تا توسعه کامل سیستم خونی تغییرات قابل &lrm;توجهی را تجربه می‌کند. لذا، این مطالعه برای تعیین مناسب&lrm; ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی ایران از طریق آنالیز خون با استفاده از طیف‌سنجی میکرو رامان UniRAM اجرا شد. مواد و روش‌ها: تخم‌ مرغ‌های بارور به &lrm;منظور طی&lrm; کردن مراحل جنینی به دستگاه جوجه &lrm;کشی در دمای 37/8 درجه سانتی&lrm; گراد و رطوبت 53 درصد درون دستگاه جوجه &lrm;کشی قرار داده شدند. جنین&lrm; ها در سنین 53/3، 5، 8 و 13 روزگی به &lrm;طور جداگانه با استفاده از دستگاه طیف‌سنجی میکرو-رامان  UniRAMبا طول موج 785 نانومتر تحت ارزیابی قرار گرفتند. به &lrm;منظور نمایش رگ‌های جنینی، یک سیستم دوربین توسعه &lrm;یافته است که به‌ طور خودکار رگ مناسب را شناسایی&lrm; و تمرکز پرتو لیزر را روی آن متمرکز می‌کند. طیف‌های به &lrm;دست&lrm;‌ آمده از طیف &lrm;سنج رامان با استفاده از نرم‌افزار Origin رسم&lrm; شدند و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. از جمله شاخص&lrm; های اصلی مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل طیف رامان، شدت پیک&lrm; های رامانی و نسبت شدت پیک&lrm; های غالب بودند. پس از اتمام مراحل آنالیز، به &lrm;منظور تأیید جنسیت جنین&lrm; ها، آن&lrm; ها از تخم&lrm;‌مرغ خارج شدند و فرآیند استخراجDNA  با استفاده از کیت استخراج Animal Tissue DNA Isolation ساخت شرکت دنازیست انجام شد. سپس کمیت و کیفیت DNA استخراج&lrm; شده با استفاده از دستگاه نانودراپ (مدل Thermo Scientific NanoDROP. 2000C، کشور آمریکا) و الکتروفورز ژل مورد بررسی قرار گرفتند. ژن اتصال DNA، کروموبوکس هلیکاز 1 (CHD) به &lrm;&lrm;عنوان ژن تعیین جنسیت استفاده شد و آغازگرهای اختصاصی برای آن طراحی شدند. به &lrm;منظور تعیین جنسیت نمونه &lrm;ها با استفاده از آغازگرهای طراحی شده، ابتدا واکنش زنجیره&lrm;ای پلیمراز (PCR) انجام گرفت و در نهایت نتیجه آزمایش روی ژل آگارز دو و نیم درصد مشاهده شد. یافته &lrm;ها: طبق نتایج این مطالعه، تفاوت‌های معنی‌داری در میانگین شدت فلورسانس بین جنس‌های نر و ماده تخم‌&lrm;مرغ‌ها مشاهده شدند، هر چند که همپوشانی زیادی وجود داشت. یکی از نمودارهای مورد بررسی در این پژوهش نمودار شمعی بود؛ این نمودار نشان می‌دهد که چگونه پیک‌های غالب در روزهای مختلف جوجه‌کشی برای تخم&lrm;‌مرغ‌های مورد آزمایش توزیع شده‌اند. همچنین، این نمودار توزیع آماری داده‌ها را نشان می‌دهد که اطلاعاتی در مورد شاخص‌های مرکزی را در بر دارد. در نهایت، بیشترین تفاوت شدت فلورسانس در روز 3/5 جوجه‌کشی ثبت شد، جایی&lrm; که طیف فلورسانس خون نر و ماده شکل‌های متمایزی را نشان داد. پس از روز 4 جوجه&lrm; کشی، شدت فلورسانس در جوجه‌های نر بیشتر باقی ماند، اما شکل طیفی به &lrm;سرعت کاهش یافت و تا روز 5 به &lrm;طور کامل از بین رفت. این تفاوت‌ها به &lrm;&lrm;دلیل تفاوت در تولید گلبول‌های قرمز و هموگلوبین متفاوت بین دو جنس‌ و تأثیر کروموزوم‌های جنسی بر ساختار گنادها هستند. تفاوت در مقدار هموگلوبین به تفاوت در اشباع اکسیژن خون نرها و ماده‌ها مرتبط است، به &lrm;طوری &lrm;که خون نر احتمالاً دارای میل اکسیژن بیشتری نسبت به خون ماده است. جوجه‌های نر دارای کروموزوم‌های ZZ و جوجه‌های ماده دارای کروموزوم‌های ZW هستند که این تفاوت در ساختار ژنتیکی منجربه تمایز در ویژگی‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی و تمایز در ساختار گنادها می‌شود. برای تایید نتایج تعیین جنسیت توسط طیف‌سنجی میکرورامان از واکنش زنجیره&lrm;ای پلیمراز استفاده شد. نتایج الکتروفورز ژل آگاروز، دو باند با طول&lrm; های 461 و 322 جفت &lrm;باز را برای جنین&lrm; های با جنسیت ماده (ZW) و یک قطعه به طول 461 جفت&lrm;باز را برای جنین&lrm; های با جنسیت نر (ZZ) نشان دادند. نتیجه&lrm; گیری: با توجه به بررسی &lrm;های انجام &lrm;شده در این مطالعه، روز 3/5 انکوباسیون به &lrm;&lrm;عنوان مناسب &lrm;ترین زمان برای تعیین جنسیت جنین مرغ بومی با استفاده از طیف‌سنجی میکرو رامان شناخته شد. از جمله مزایای روش‌های طیف‌سنجی و فلورسانس شامل دقت زیاد و زمان تحلیل کوتاه هستند که می‌توانند به توسعه سیستم‌های صنعتی برای تعیین جنسیت تخم‌مرغ‌ها کمک کنند. این روش ترکیبی از تکنیک‌های پیشرفته طیف‌سنجی رامان و تجزیه و تحلیل ژنتیکی برای تعیین جنسیت جوجه‌ها در مراحل اولیه جوجه‌کشی را ارائه می‌دهد که می‌تواند به &lrm;طور مؤثری در صنعت طیور مورد استفاده قرار گیرد.</div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: Currently, the sex of poultry based on physical differences between males and females is determined by skilled technicians. This requires skilled labor and is time-consuming. Raman spectroscopy is an analytical technique that relies on light scattering and the vibrational effects of molecules. It is recognized as a non-destructive tool for analyzing chemical structures and identifying various substances. This method was first discovered by the Indian physicist Chandra Sekhar Venkata Raman in 1930, for which he was awarded the Nobel Prize. In this technique, samples are excited using a laser, and the light that is scattered from them provides valuable information about their structures and biochemical properties. One significant application of Raman spectroscopy is in determining the sex of chicks in eggs. Due to biochemical differences between the cells of male and female birds, this technique can help identify the gender of eggs through blood cell analysis. This is particularly important in the poultry industry because chicks of the unwanted sex are usually killed after hatching, and employing Raman spectroscopy can help reduce this economic and ethical waste. As chick embryos develop, their blood composition undergoes significant changes, starting from the initial production of red blood cells to the full development of their circulatory system. Consequently, this study was conducted to determine the optimal time for identifying the sex of Iranian native chicken embryos through blood analysis using micro-Raman spectroscopy. Methods: Fertilized eggs were incubated at a temperature of 37.8 °C and 53% humidity to facilitate embryonic development. Embryos at different ages—3.5, 5, 8, and 13 days—were evaluated separately using a UniRAM Microraman spectrometer with a wavelength of 785 nm. To visualize the embryonic vessels, a specialized camera system was developed that automatically identified the relevant vessel and focused the laser beam on it. The spectra obtained from the Raman spectrometer were plotted and analyzed using Origin software, with key indicators (such as the intensity of Raman peaks and the intensity ratio of dominant peaks) being utilized for analysis. Among the main indicators used to analyze the Raman spectrum were the intensity of Raman peaks and the intensity ratio of dominant peaks. To confirm the gender of the embryos after completing the analysis process, they were removed from the eggs, and the DNA extraction process was carried out using the Animal Tissue DNA Isolation kit manufactured by Denazist. The quantity and quality of the extracted DNA were assessed using a NanoDrop device (Thermo Scientific NanoDroP 2000C, USA) and gel electrophoresis. The CHD gene was employed as a sex-determining marker, for which specific primers were designed. The polymerase chain reaction (PCR) was conducted to determine the sex of the samples using these primers, and the results were observed on a 2.5% agarose gel. Results: The results of this study revealed significant differences in the average fluorescence intensity between male and female eggs, although there was considerable overlap. One of the charts examined in this research was the candlestick chart, which shows how the dominant peaks are distributed on different days of incubation for the tested eggs. In addition, this chart shows the statistical distribution of the data, which includes information about the central indicators. Finally, this chart also provided a statistical distribution of the data, highlighting central indices. The most pronounced difference in fluorescence intensity was observed on day 3.5 of incubation, where the fluorescence spectra of male and female blood exhibited distinct shapes. After day 4, the fluorescence intensity remained higher in male chicks; however, the spectral shape diminished rapidly and was completely lost by day 5. These variations can be attributed to differences in the production of red blood cells and hemoglobin between the sexes, as well as the influence of sex chromosomes on the gonadal structure. The difference in hemoglobin levels is related to the difference in the oxygen saturation of the blood of males and females, so that male blood is likely to have a higher oxygen affinity than female blood. Male chickens possess ZZ chromosomes, while female chickens have ZW chromosomes. This genetic distinction leads to differences in physiological and biochemical characteristics, as well as variations in the gonadal structure. Male chickens have ZZ chromosomes and female chickens have ZW chromosomes. This difference in the genetic structure leads to differences in physiological and biochemical characteristics and differentiation in the structure of the gonads. PCR was used to confirm the Raman spectroscopy results. The results of agarose gel electrophoresis showed two bands with lengths of 461 and 322 base pairs for female embryos (ZW) and one fragment with a length of 461 base pairs for male embryos (ZZ). Conclusion: According to the findings of this study, day 3.5 of incubation was identified as the optimal time for determining the gender of native chicken embryos using micro-Raman spectroscopy. This method boasts several advantages, including high accuracy and a short analysis time, which are essential for developing industrial systems aimed at sexing eggs. By combining advanced techniques from Raman spectroscopy with genetic analysis, this approach allows for effective gender determination of chickens in the early stages of hatching, making it particularly beneficial for the poultry industry.  </div> تعیین جنسیت, جنین مرغ, طیف‎سنجی رامان Sex determination, Chicken embryo, Raman spectroscopy 158 167 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1914-2&slc_lang=fa&sid=1 Sepideh Rostami سپیده رستمی s.rostami1585@gmail.com 100319475328460026796 100319475328460026796 No Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران mohammadtaghi beiginassiri محمدتقی بیگی نصیری mt_nassiri@yahoo.com 100319475328460026797 100319475328460026797 Yes Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران Mahmoud Nazari محمود نظری fat_sa_2005@yahoo.com 100319475328460026798 100319475328460026798 No Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران Mohsen cheraghizadeh محسن چراغی زاده mcheraghizade@yahoo.com 100319475328460026799 100319475328460026799 No Advanced Surface Engineering and Nano Materials Research Center, Department of Electrical Engineering, Ahvaz Branch, IAU, Ahvaz, Iran مرکز تحقیقات مهندسی سطح پیشرفته و نانو مواد، گروه مهندسی برق، دانشگاه آزاد واحد اهواز، اهواز، ایران