Research on Animal Production

fa نشانگرهای زیستی مرتبط با پاسخ ایمنی به ویروس آنفولانزا مبتنی ‎بر رویکرد زیست‌شناسی سامانه‌ای در مرغ Biomarkers Related to Immune Response to the Influenza Virus based on the Systems Biology Approach in Chickens ژنتیک و اصلاح نژاد دام ژنتیک و اصلاح نژاد دام پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: در سال‌های اخیر، ویروس آنفولانزا منجربه خسارات اقتصادی سنگینی در صنعت طیور به&lrm; ویژه گله‌های گوشتی شده &lrm;است که علی&lrm;رغم انجام برنامه واکسیناسیون، همچنان از مهم&lrm;ترین عوامل بیماری &lrm;زا در صنعت طیور در سراسر جهان است. آنفولانزای پرندگان، به‌ویژه سویه H5N1، به&lrm;دلیل پتانسیل آن به&lrm;عنوان بیماری مشترک بین انسان و دام و تأثیر مخرب آن بر جمعیت طیور، به&lrm;عنوان نگرانی&lrm; عمده بهداشت جهانی مطرح شده &lrm;است. با این انگیزه تحقیقاتی، شناسایی مکانیسم‌های مولکولی پاسخ به عفونت برای کنترل، درمان و پیشگیری از بیماری همه‌گیر، امری حیاتی است. از جمله اهداف کلیدی در تحقیقات زیستی، شناسایی منسجم تمام مولکول‌های درون&lrm; سلولی زنده و نحوه تعامل بین آن&lrm;ها است. بیان هم&lrm;زمان ژن، اطلاعات کلیدی را برای درک سیستم‌های زنده فراهم می‌کند، زیرا ژن‌های هم‌‌بیان اغلب در مسیرهای زیستی یکسان یا مرتبط با برهمکنش پروتئین_پروتئین (PPI) هستند. نیاز به استراتژی‌های موفق درمانی نگارندگان را به مطالعه شبکه‌های تعامل پروتئین-پروتئین از طریق رویکردهای مبتنی&lrm; بر زیست‌شناسی سیستمی به&lrm;عنوان روشی مناسب برای کشف پروتئین‌های کاندید و مسیرهای بیولوژیکی کلیدی در این بیماری واداشته است. از آن&lrm;جایی&lrm; که اندازه‌گیری شاخص‌های مرکزیت معیاری برای تعیین تأثیر عضوها در شبکه تعاملی است، از شاخص‌های مرکزیت بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال عضو برای تجزیه و تحلیل شبکه‌های پروتئینی استفاده می‌شود. این مطالعه، با هدف شناسایی نشانگرهای زیستی کلیدی در تشخیص، درمان یا کنترل تلفات و خسارات ناشی از بیماری آنفولانزای مرغی با استفاده از روش‌های آنالیز شبکه‌های زیستی و تحلیل مسیرهای سیگنال‌دهی-عملکردی انجام شد. مواد و روش&lrm; ها: در مطالعه حاضر، پایگاه ‌داده هم‌بیانی ژن (COXPRESdb) با استفاده از کلیدواژهResponse to virus  جستجو شد. در نتیجه جستجو، مجموع 21 ژن که در فرآیندهای بیولوژیکی پاسخ به ویروس در مرغ نقش دارند، معرفی شدند. از میان 21 ژن معرفی شده، 7 ژن در دو شبکه هم‌بیانی ژن مجزا حضور داشتند. با توسعه دو شبکه‌ هم‌بیانی ژن، در نهایت 148 ژن، در 12 خوشه ژنی مجزا با هدف شناسایی سایر مؤلفه‌های هم‌بیانی ژنی، از پایگاه‌داده COXPRESdb شناسایی و استخراج شدند. جهت حاشیه&lrm; نویسی شبکه مورد مطالعه، داده بیانی سریGSE53932  از بخش GEO بانک اطلاعاتNCBI استخراج شد. تحلیل آماری و آنالیز بیان ژن‌ها توسط نرم &lrm;افزار GEO2R انجام شد و ژن‌های با بیان افتراقی با ( 0.05> P) و (2 > Log FC > 2-) مشخص گردیدند. شبکه‌های فرعی توسط افزونه‌های MCODE،jActiveModules 3.1  و CytoCluster 2.1.0با نرم‌افزار Cytoscape شناسایی شدند. پارامترهای MCODE شامل برش تعداد اتصال عضو: 2، برش امتیاز عضو: 0/5،K-score : 5 و حداکثر عمق: 100 در نظر گرفته شدند. با استفاده از افزونه jActiveModules براساس داده‌های بیان واردشده به شبکه، زیرشبکه‌های بیانی فعال با درنظر گرفتن (adj.P < 0.01) شناسایی شدند. از افزونه‌ CytoCluster جهت خوشه‌بندی شبکه براساس P-value برای شناسایی خوشه‌های معنی‌دار ( 0.05> P) استفاده شد. به&lrm; منظور محاسبه پارامترهای مرکزیت شامل پارامترهای بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال برای هر عضو و شناسایی ژن‌های اصلی (هاب‌ها)، از افزونه CentiScaPe 2.1 در شبکه استفاده شد. عبارات هستی‌شناسی ژن (GO) زیرشبکه‌ها و خوشه‌های شناسایی&lrm; شده با استفاده از ابزار حاشیه‌نویسی عملکردی DAVID بازیابی شدند. در نهایت، شبکه هستی‌شناسی ژن‌ها به&lrm; وسیله افزونه‌های ClueGO 2.5.10 و CluePedia 1.5.10 ترسیم شد. یافته&lrm; ها: از میان فهرست 21 ژن پاسخ به ویروس‌ها در مرغ، هفت ژن در دو شبکه هم‌بیانی مجزا حضور داشتند. این دو شبکه هم‌بیانی شامل سه ژن TTR، ALB و RBP4A و چهار ژن SAMHD1، MX1، IRF7 و MYD88 بودند. علاوه &lrm;بر ژن‌های حاشیه‌نویسی&lrm; شده در جریان پاسخ به ویروس در مرغ، فهرست ژنی حاوی 148 ژن‌ محتمل پاسخگو به ویروس با انحراف امتیاز هم‌بیانی در اطراف 3 < Z، به&lrm;عنوان هم‌بیانی بالاتر نسبت به توزیع نرمال هم‌بیانی تصادفی، از پایگاه‌داده هم‌بیانی ژن COXPRESdb استخراج شدند. بعد از تحلیل آماری داده‌های بیانی، شبکه تعاملی اولیه برای ژن‌ها با بیان افتراقی معنی‌دار به&lrm;صورت 61 عضو (پروتئین) و 306 اتصال با استفاده از نرم‌افزار Cytoscape ایجاد شد. دو شبکه PPI توسط سه پروتئین PLAC8L1، LBFABP و IFI6 به&lrm; هم مرتبط شدند. پروتئین‌هایSERPlNA10  و AHSG با امتیاز عضو 22 و PLG با امتیاز عضو 21 به&lrm;عنوان پروتئین‌های هاب (Hub)، دارای بیشترین میزان تعامل در کل شبکه پروتئین‌ها با بیان افتراقی بودند. محاسبه با افزونه MCODE منجربه شناسایی دو خوشه با چگالی بالا شد. این مناطق با چگالی بالا در شبکه ممکن است شامل پروتئین‌هایی باشند که به&lrm;عنوان مجموعه‌ای در سلول عمل ‌کنند. AMBP و DDX60 به&lrm;عنوان پروتئین‌های Seed به&lrm; ترتیب در خوشه شماره 1 و 2 حضور داشتند. پس از افزودن داده‌های بیان به عضو‌های شبکه در نرم‌افزار Cytoscape، محاسبه و خوشه‌بندی با استفاده از افزونه jActiveModules، پنج زیرشبکه‌ بیانی فعال شناسایی شدند. دو خوشه‌ ژنی معنی‌دار ( P< 0.05) با استفاده از افزونه CytoCluster 2.1.0  (الگوریتم ClusterOne) با درنظر گرفتن مقدار (0.05 > P) شناسایی شدند. اولین خوشه معنی‌دار با 25 عضو در سمت راست شبکه شامل پروتئین‌هایی بود که مسیر سیگنال‌دهی بیوسنتز فنیل آلانین، تیروزین و تریپتوفان را نشان دادند. دومین خوشه معنی‌دار با 20 عضو در سمت چپ شبکه شامل پروتئین‌هایی بود که مسیر سیگنال‌دهی آنفولانزای A، عفونت ویروس هرپس سیمپلکس 1 و مسیر سیگنال‌دهی گیرنده RIG-I را به&lrm;عنوان مسیر درگیر در پاسخ ایمنی به ویروس‌ نشان دادند. محاسبات شاخص‌های مرکزیت برای زیرشبکه‌های بیانی فعال حاصل از الگوریتم jActiveModules پس از افزودن داده‌های بیان و برای خوشه‌های حاصل از الگوریتم‌های MCODE قبل از افزودن داده‌های بیان نیز انجام شدند. در نهایت، پروتئین‌های IFIT5،  IFIH1وRSAD2  در خوشه‌های به &lrm;دست‌آمده از الگوریتم MCODE (خوشه با بالاترین امتیاز) و CytoCluster و پروتئین IFIH1 در زیرشبکه فعال بیانی به‌دست‌آمده از jActiveModules، دارای بالاترین امتیاز بینابینی، نزدیکی و تعداد اتصال عضو بودند. در بررسی غنی‌سازی ژنی KEGG، این سه پروتئین به &lrm;همراه چهار پروتئین STAT1، EIF2AK2، TRIM25 و دPLG به&lrm;صورت معنی‌دار‌ (0.05 > P) با مسیر سیگنال‌دهی آنفولانزای A، عفونت ویروس هرپس&lrm;سیمپلکس 1، بیوسنتز فنیل&lrm;آلانین، تیروزین و تریپتوفان، متابولیسم فنیل‌آلانین و مسیر سیگنال‌دهی گیرنده RIG-I در پاسخ ایمنی به ویروس آنفولانزا‌ در ارتباط بودند. نتیجه‌گیری: در نتیجه مطالعه حاضر‌، پروتئین‌های IFIH1، IFIT5، و RSAD2 با بالاترین امتیاز شاخص‌های مرکزیت برای خوشه‌ها و زیرشبکه‌های بیانی فعال و STAT1، PLG، EIF2AK2، DHX58 و TRIM25 با بالاترین سطح معنی‌داری (P< 0.05) در مسیرهای سیگنال‌دهی انفولانزای A و مسیر سیگنال‌دهی گیرنده RIG-I در طیور به&lrm;عنوان نشانگرهای زیستی پاسخگو به آنفولانزا معرفی شدند. </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: In recent years, the influenza virus has caused severe economic losses in the poultry industry, particularly in meat production, and remains one of the most important pathogens in the poultry industry worldwide despite vaccination programs. Avian influenza, especially H5N1, has become a major global health problem due to its potential as a zoonotic disease and its devastating impact on poultry populations. Identifying the molecular mechanisms of response to infections is crucial for the control, treatment, and prevention of epidemic diseases. A central goal of biological research is the coherent identification of all molecules in a living cell and their interactions. Co-expression of genes provides valuable information for understanding living systems because co-expressed genes often act in the same biological pathways or are linked through protein-protein interactions (PPI). The need for effective therapeutic strategies prompted the authors to investigate protein-protein interaction networks using systems biology approaches as a suitable method to discover candidate proteins and key biological pathways related to this disease. Since centrality indices measure the influence of nodes in an interaction network, betweenness, closeness, and degree centrality indices were used to analyze protein networks. This study aims to identify important biomarkers for the diagnosis, treatment, or control of the losses caused by avian influenza using biological network and signaling pathway analysis methods. Methods: In the present study, the COXPRESdb gene co-expression database was searched using the keyword “response to the virus.” As a result, 21 genes were identified as involved in the biological processes of virus response in chickens. Of these 21 genes, seven were presented in two separate gene co-expression networks. Two gene co-expression networks were developed, and a total of 148 genes were extracted from the COXPRESdb database in 12 distinct gene clusters to identify other gene co-expression components. To annotate the studied network, gene expression data from the GSE53932 series were extracted from the GEO database of NCBI. After statistical analysis, gene expression analysis was performed using GEO2R software to identify differentially expressed genes (P < 0.05 and -2 < Log FC < 2). Subnetworks were detected using the MCODE, jActiveModules 3.1, and CytoCluster 2.1.0 plugins in Cytoscape software. MCODE parameters included degree cut: 2, nodal cut: 0.5, K-score: 5, and maximum depth: 100. Using the jActiveModules plugin, active expression subnetworks were identified based on the expression data (adj.P < 0.01). The CytoCluster plugin was used to group the network based on P-values to identify significant clusters (P < 0.05). The CentiScaPe 2.1 plugin was used to calculate centrality parameters, including betweenness, closeness, and degree, for each node and to identify hubs. Gene Ontology (GO) terms for the identified subnetworks and clusters were retrieved using the DAVID functional annotation tool. Finally, the ontology network of genes was visualized using the ClueGO 2.5.10 and CluePedia 1.5.10 plugins. Results: From the 21 virus-responsive genes in chickens, seven genes were present in two separate co-expression networks. These two networks included three genes (TTR, ALB, and RBP4A) and four genes (SAMHD1, MX1, IRF7, and MYD88). In addition to the genes annotated during the virus response in chickens, a gene list of 148 possible virus-responsive genes with a co-expression score deviation (Z > 3) was identified, as the co-expression exceeded the normal distribution of random co-expression. Expression data were extracted from the COXPRESdb gene co-expression database. After statistical analysis of the expression data, the initial interaction network for genes with significant differential expression was created with 61 nodes (proteins) and 306 edges using Cytoscape software. Two PPI networks were connected by three proteins: PLAC8L1, LBFABP, and IFI6. SERPINA10 and AHSG proteins, with node scores of 22, and PLG, with a node score of 21, were identified as hub proteins with the highest interaction rates in the entire network of differentially expressed proteins. Two high-density clusters were identified using the MCODE plugin. These high-density regions may contain proteins that function as complexes within the cell. AMBP and DDX60 were identified as seed proteins in clusters 1 and 2, respectively. After adding expression data to network nodes in Cytoscape software, clustering and calculations with the jActiveModules plugin identified five active expression subnetworks. Two significant gene clusters (P < 0.05) were identified using the CytoCluster 2.1.0 plugin (ClusterOne algorithm, P < 0.05). The first significant cluster, with 25 nodes, includes proteins involved in the phenylalanine, tyrosine, and tryptophan biosynthesis pathway. The second significant cluster, with 20 nodes, includes proteins related to the influenza A signaling pathway, herpes simplex virus infection, and the RIG-I receptor signaling pathway, which are involved in the immune response to the virus. Centrality indices were calculated for active expression subnetworks obtained using the jActiveModules algorithm after adding expression data and for clusters obtained with the MCODE algorithm before adding expression data. Finally, the IFIT5, IFIH1, and RSAD2 proteins in the clusters obtained by the MCODE algorithm (the highest cluster score) and the IFIH1 protein in the active expression subnetwork obtained by jActiveModules had the highest betweenness, closeness, and degree values. In KEGG gene enrichment analysis, these three proteins, along with STAT1, EIF2AK2, TRIM25, and PLG, were significantly (P < 0.05) associated with the influenza A signaling pathway, herpes simplex virus 1 infection, and other related pathways. Conclusion: This study identified the proteins IFIH1, IFIT5, and RSAD2 as having the highest centrality index values for active expression clusters and subnetworks, and STAT1, PLG, EIF2AK2, DHX58, and TRIM25 as key biomarkers for influenza A response. These proteins, along with the associated signaling pathways, including the RIG-I receptor signaling pathway, offer potential targets for the diagnosis, treatment, and control of avian influenza in poultry.</div> آنفولانزا, شاخص مرکزیت, شبکه‎ تعاملی پروتئین-پروتئین, هم‌بیانی ژن, KEGG Centrality index, Gene co-expression, Influenza, KEGG, Protein-protein interaction network 29 42 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-452-6&slc_lang=fa&sid=1 Mehre Mohammadnezhad مهره محمدنژاد mehremohammadnejad@gmail.com 100319475328460025715 100319475328460025715 No Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران Mohsen Gholizadeh محسن قلی ‎زاده mh_gholizadeh@yahoo.com 100319475328460025716 100319475328460025716 Yes Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران Hasan Hafezian حسن حافظیان hassanhafezian@yahoo.com 100319475328460025717 100319475328460025717 No Department of Animal Science, Faculty of Animal Science and Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran گروه علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، ساری، ایران