Research on Animal Production

fa شناسایی واریانت‎‌های مهم ژن‎‌های کد‎کننده آنزیم ATPase و سیتوکروم b ژنوم میتوکندری در گاوهای هلشتاین و کلیستانی Identification of Important Variants of ATPase and Cytochrome b Coding Genes of the Mitochondrial Genome in Holstein and Cholistani Cows ژنتیک و اصلاح نژاد دام ژنتیک و اصلاح نژاد دام پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: انتخاب طی سالیان گذشته باعث شده&lrm;‌است که دام&lrm;های اصلاح&lrm;شده تجاری در مقایسه با دام&lrm;های بومی از مقاومت ژنتیکی و قدرت سازگاری کمتری برخوردار باشند که دلیل آن کاهش تنوع ژنتیکی است. لازمه اجرای هر گونه برنامه&lrm; اصلاح نژادی جهت سازگاری سریع نسبت به تغیرات محیطی است. در مطالعات گذشته که به&lrm;منظور بررسی تجزیه تفریقی ژن&lrm;ها در نژادهای هلشتاین و کلیستانی استان پنجاب پاکستان انجام &lrm;گرفتند، در برخی از ژن&lrm;ها از جمله ژن&lrm;های میتوکندری تفاوت بیان بسیار فاحش مشاهده &lrm;گردید که به&lrm;عنوان پایه مطالعه حاضر قرارگرفت. لذا هدف از تحقیق حاضر، بررسی دلایل تفاوت بیان ژن متفاوت بین دو نژاد گاو هلشتاین و کلیستانی در ژن&lrm;های میتوکندری شامل ژن&lrm;های ATP6، ATP8 و CYTB که در فرآیندهای مهمی از جمله متابولیسم انرژی در مقابله با تنش&lrm;های زیستی و غیر زیستی و نیز مقاومت به بیماری نقش دارند، با استفاده از داده&lrm;های ترانسکریپت (RNA-Seq) بود. به این منظور، پوشش ترانسکریپتومی، نواحی و جهش&lrm;های نوکلئوتیدی و پروتئینی و اختلافات ژنتیکی حذف و اضافه در ژنوم میتوکندری این دو نژاد مورد بررسی قرارگرفتند. مواد و روش&lrm;ها: در مطالعه حاضر، از داده&lrm;های ترانسکریپتوم (RNA-Seq) با دسترسی آزاد 40 نمونه از گاوهای شیری دانشگاه ویسکانسین آمریکا و 45 گاو ماده کلیستانی از واحد گاو شیری گوجاتیپیر شهر باهاوالپور واقع در ایالت پنجاب پاکستان استفاده گردید. با توجه به این&lrm; که نتایج بیان افتراقی دو نژاد در تعدادی از ژن&lrm;های میتوکندری بیان متفاوتی را نشان دادند و بخشی از اختلافات مربوط به ساختار ژنتیکی متفاوت آن&lrm;ها در دو نژاد است، هدف مطالعه حاضر قرارگرفت. با استفاده از پایگاه&lrm;های داده ژنومی NCBI به آدرس (<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a>) و Ensembl به آدرس (<a href="https://asia.ensembl.org/index.html">https://asia.ensembl.org/index.html</a>) توالیهای سه ژن&lrm; میتوکندریایی شامل ATP6،  ATP8 و CYTB برای نژاد گاو هلشتاین (Bos taurus) و نژاد گاو کلیستانی (Bos indicus) استخراج و به فرمت FASTA ذخیره گردیدند. جهت بررسی سطح پوشش ترانسکریپتومی از نرم&lrm;افزار IGB نسخه 6 استفاده شد. جهت محاسبه نواحی چندشکل و همچنین محاسبه درصد جایگزینی نوکلئوتیدها و هم&lrm;ردیف&lrm;سازی توالی&lrm;ها از نرم&lrm;افزار MEGA6 استفاده شد. برای تعیین انواع چندشکلی&lrm;های به وقوع پیوسته در ژنوم میتوکندری هلشتاین و کلیستانی با استفاده از توالی&lrm;های نوکلئوتیدی و آمینواسیدی و همچنین بلوک&lrm;های هاپلوتیپی، تعیین نواحی حذف و اضافه، درج و مناطق حفاظت شده در ژنوم از نرم&lrm;افزار Dnasp5 استفاده گردید. یافته&lrm;ها: تعداد نواحی حذف در نژاد هلشتاین در سه جایگاه ژنی ATP6، ATP8 و CYTB به&lrm;ترتیب 96، 28 و 91 موقعیت حذف بودند که بیشتر از تعداد نقاط حذف نژاد کلیستانی (در مقابل 84، 9 و 57) بودند. در نژاد کلیستانی در جایگاه ژنی ATP6 در موقعیت 8733 جفت بازی یک درج به&lrm;طول 64 جفت&lrm;بازی و در جایگاه ژنی CYTB دو ناحیه درج در موقعیت&lrm;های 15846 و 14779 جفت&lrm;بازی به&lrm;طول 17 و 24 جفت رخ داد. در جایگاه ATP8 در نژاد کلیستانی هیچ درجی مشاهده نشد. در نژاد هلشتاین در جایگاه ATP8 یک ناحیه درج در موقعیت 8185 به&lrm;طول 16 جفت&lrm;باز، در جایگاه ژنی ATP6 یک ناحیه درج در موقعیت 8733 جفت&lrm;بازی به&lrm;طول 20 جفت&lrm;باز و در جایگاه CYTB سه ناحیه درج در موقعیت&lrm;های 14779، 15355 و 15356 به&lrm;ترتیب درج&lrm;های به&lrm;طول 27، 42 و 16 جفت&lrm;باز مشاهده شدند. از بین سه جایگاه ژنی، جایگاه ATP6 بالاترین سطح پوشش و ATP8 کمترین پوشش را داشت و جایگاه CYTB در حدواسط دو جایگاه دیگر قرار داشت. مقایسه توالی&lrm;های نوکلئوتیدی جایگاه ژنی ATP6 با طول ۶۷۸ جفت&lrm;باز در دو نژاد هلشتاین و کلیستانی، هشت ناحیه چندشکلی و براساس توالی آمینواسیدی سه ناحیه چندشکلی شامل دو تبدیل ترئونین به آلانین و یک موقعیت تبدیل ایزولوسین به والین را نشان داد. مقایسه توالی&lrm;های نوکلئوتیدی جایگاه ژنی ATP8 با طول ۱۹۸ جفت باز در دو نژاد هلشتاین و کلیستانی، شش ناحیه چندشکلی و براساس توالی آمینواسیدی، دو ناحیه چندشکلی را نشان داد. تغییرات آمینواسیدی شامل تبدیل والین به ایزولوسین و ترئونین به آلانین بودند. مقایسه توالی&lrm;های نوکلئوتیدی جایگاه ژنی CYTB با طول ۱۱۳۷ جفت&lrm;باز در دو نژاد هلشتاین و کلیستانی، 19 ناحیه چندشکلی و براساس توالی آمینواسیدی تنها دو ناحیه چندشکلی را نشان داد که آمینواسید والین به ایزولوسین و ایزولوسین به والین تبدیل شدند. در نهایت، نتایج حاصل از تجزیه نواحی حفاظت شده در قطعه هم&lrm;تراز شده از ژن&lrm;های ATP6، ATP8 و CYTB نشان داد که از توالی ژن&lrm;های ذکرشده، ژن ATP6 دارای یک قطعه 217 جفت&lrm;بازی حفاظت شده بود، و ژن ATP8 بدون منطقه حفاظت&lrm;شده بود. ژن&lrm;های غیر&lrm; حفاظت&lrm;شده مستعد به تغییرهای نوکلئوتیدی و جهش هستند، که سبب به&lrm;وجود آمدن پروتئین&lrm;های جدید و همچنین عملکردهای جدید آن&lrm;ها شده &lrm;است و بیشتر مناطق ژن CYTB حفاظت&lrm;شده بود. ژن&lrm; CYTB دارای بیشترین نواحی حفاظتشده در DNA به&lrm;طول 605 جفت&lrm;باز بود. همچنین، نتایج نشان دادند که جانشینی انتقالی در تمام ژن&lrm;ها بیشتر از جانشینی تقاطعی بود. نتیجه&lrm;گیری: نتایج مقایسه تجزیه ترانسکریپت&lrm;های دو نژاد هلشتاین و کلیستانی، علاوه&lrm;بر بیان متفاوت در ژن&lrm;های مختلف از جمله ژنوم میتوکندری و تجزیه تکمیلی توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی ژن&lrm;های ATP6، ATP8 و CYTB، نشان داد که عوامل تکامل از جمله جهش&lrm;ها، انتخاب و مهاجرت سه عامل از مهم&lrm;ترین عواملی بودند که موجب تغییر در ساختار ژنتیکی نژادها و از جمله هلشتاین شدند، به&lrm;نحوی که تغییرات مذکور موجب بیان متفاوت در ژن&lrm;های میتوکندری در دو نژاد شدند. لذا به&lrm;منظور بهبود سازگاری نژادهای تجاری می&lrm;توان با طراحی برنامه&lrm;های مناسب آمیخته&lrm;گری و انتخاب ژنومیک موجب ترکیب واریانت&lrm;های تأثیر&lrm;گذار شده، طول عمر اقتصادی دام&lrm;های تجاری را در ترکیب با دام&lrm;های بومی افزایش داد.</div> <div class="WordSection1"> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract</div> <pre style="text-align: justify;"> Background: Selection over the past years has caused commercially modified livestock to have less genetic resistance and adaptability compared to native livestock, which is the reason for the reduction of genetic diversity. It is necessary to implement breeding programs to quickly adapt to environmental changes. In the past studies that were conducted to investigate the differential analysis of genes in the Holstein and Cholistani breeds of the Punjab province in Pakistan, a very significant difference in expression was observed in some genes, including mitochondrial genes, which became the basis of the present study. Therefore, this research aims to investigate the reasons for the difference in gene expression between Holstein and Cholistani cattle breeds in mitochondrial genes, including ATP6, ATP8, and CYTB genes, which are involved in important processes such as energy metabolism in dealing with biotic and abiotic stresses, and also play a role in disease resistance, using transcript data (RNA-Seq). For this purpose, transcriptome coverage, nucleotide and protein regions and mutations, and deletion and addition genetic differences were investigated in the mitochondrial genome of these two breeds.</pre> <div style="text-align: justify;">Methods: Transcriptome data (RNA-Seq) with free access to 40 samples of dairy cows from the University of Wisconsin, USA, and 45 female cows of Cholistani from the Gujatipir dairy cow unit of Bahawalpur City, located in the Punjab state of Pakistan, were used in the present study. Since the results of the differential gene expression of the two breeds showed different expression levels in several mitochondrial genes, and part of the differences were related to their different genetic structures in the two breeds, the present study aimed to investigate this topic. Using NCBI genome databases (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and Ensemble (https://asia.ensembl.org/index.html), the sequences of three mitochondrial genes, including ATP6, ATP8, and CYTB, for Holstein cattle (Bos taurus) and Cholistani cattle (Bos indicus) were extracted and stored in FASTA format. IGB version 6 software was used to examine the level of transcriptomic coverage. MEGA6 software was used to calculate the polymorphic regions and to calculate the percentage of nucleotide substitution and alignment of the sequences. The types of polymorphisms occurring in the mitochondrial genomes of Holstein and Cholistani using nucleotide and amino acid sequences, as well as haplotype blocks, were specified by determining insert and deletion regions and protected regions in the genome using Dnasp5 software. </div> <pre style="text-align: justify;"> Results: Deletion sites in the Holstein breed in the three ATP6, ATP8, and CYTB gene loci were 96, 28, and 91, respectively, which were more than the number of deletion points in the Cholistani breed (vs. 84, 9, and 57). In the Cholistani breed, there was an insertion of 64 bp in the ATP6 gene locus at position 8733 bp, and two insertion regions in the CYTB gene locus at positions 15846 and 14779 bp, 17 and 24 bp in length, respectively. No insertion was observed in the ATP8 locus in the Cholistani breed. In the Holstein breed, there was an insertion region at position 8185 with a length of 16 bp in the ATP8 locus, an insertion region at position 8733 bp with a length of 20 bp in the ATP6 gene locus, and in the CYTB gene, three insertion regions were observed at positions 14779, 15355, and 15356, respectively, 27, 42, and 16 base pairs in length. Among the three gene loci, ATP6 and ATP8 showed the highest and the lowest levels of coverage, respectively, and CYTB was in the middle of the other two loci. The comparison of the nucleotide </pre> </div> <div style="text-align: justify;"><div aria-label="Page Break" class="cke_pagebreak" contenteditable="false" data-cke-display-name="pagebreak" data-cke-pagebreak="1" style="page-break-after:always" title="Page Break"></div></div> <pre style="text-align: justify;"> sequences of the ATP6 gene locus with a length of 678 base pairs in two Holstein and Cholistani breeds showed eight polymorphic regions and three polymorphic regions based on the amino acid sequence. They included two threonine-to-alanine conversions and one isoleucine-to-valine conversion position. A comparison of the nucleotide sequences of the ATP8 gene locus with a length of 198 base pairs in Holstein and Cholistani breeds, containing six polymorphic regions, and based on the amino acid sequence, showed that they contained two polymorphic regions. Amino acid changes included valine to isoleucine and threonine to alanine. A comparison of the nucleotide sequences of the CYTB gene locus with a length of 1137 bp in the Holstein and Cholistani breeds, containing 19 polymorphic regions, and based on the amino acid sequence, revealed that only two polymorphic regions were found where the amino acid valine was converted to valine-isoleucine and isoleucine-valine. Finally, the results of analyzing the conserved regions in the aligned fragment of ATP6, ATP8, and CYTB genes showed that from the sequence of the mentioned genes, the ATP6 gene had a 217 bp conserved fragment, and the conserved region was not found in the ATP8 gene. Non-protected genes are susceptible to nucleotide changes and mutations, which have caused the coming into being of new proteins and their new functions, and most regions of the CYTB gene were protected. The CYTB gene had the most conserved regions in DNA, with a length of 605 bp. Moreover, the results showed that transitional substitution in all genes was more than transversional substitution.</pre> <div style="text-align: justify;">Conclusion: The results of the comparison analysis of transcripts in Holstein and Cholistani breeds, in addition to different expression levels in different genes, including the mitochondrial genome and complementary analysis of nucleotide and amino acid sequences of ATP6, ATP8, and CYTB genes, showed that evolutionary factors, including mutations, selection, and migration, were three of the most important factors that caused changes in the genetic structures of breeds, including Holstein, in such a way that the mentioned changes caused different expression levels of mitochondrial genes in the two breeds. Therefore, to improve the compatibility of commercial breeds, it is possible to combine effective variants and increase the economic lifespan of commercial livestock in combination with native livestock by designing suitable breeding programs and genomic selection.</div> ترانسکریپتوم, جایگزینی نوکلئوتیدی, کلیستانی, واریانت ژنتیکی, هلشتاین. Cholistani, Genetic variant, Holstein, Nucleotide substitution, Transcriptome 159 171 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-458-12&slc_lang=fa&sid=1 Ahmad Tamroosi احمد تمروسی ahmadtamroosi@gmail.com 100319475328460024877 100319475328460024877 No Department of Animal Science, College of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران Gholam Reza Dashab غلامرضا داشاب dashab@uoz.ac.ir 100319475328460024878 100319475328460024878 Yes Department of Animal Science, College of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل، زابل، ایران Mohammad Hossein Banabazi محمد حسین بناءبازی banabazi.hossein@gmail.com 100319475328460024879 100319475328460024879 No Department of Biotechnology, Animal Science Research Institute of Iran (ASRI), Agricultural Research, Education, and Extension Organization موسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ‌ترویج کشاورزی، کرج، ایران Ali Maghsoudi علی مقصودی alimaghsouditmu@gmail.com 100319475328460024880 100319475328460024880 No Department of Animal Science, College of Agriculture, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران