Research on Animal Production

fa شناسایی توکسین آلفا در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از نمونه‌های کشتارگاهی Identification of Alpha Toxin in Iranian Clostridium novyi Isolates from Slaughterhouse Samples دامپزشکی دامپزشکی پژوهشي Research <div style="text-align: justify;"><a name="_Hlk124711128"></a><a name="_Hlk124711128">چکیده مبسوط</a> مقدمه و هدف: باکتری کلستریدیوم نووئی نوع B عامل بیماری قانقاریای عفونی کبد (Black disease) در گوسفند و بز است. این باکتری سم سلولی به&lrm;نام آلفا توکسین تولید می‌کند. اسپور این باکتری از طریق دستگاه گوارش وارد بدن دام شده، پس از نفوذ به کبد و در صورت فراهم شدن شرایط لازم رشد باکتری و از جمله کم&lrm;اکسیژنی، آسیب کبدی مانند مهاجرت لارو انگل‌ها، اسپور‌های نهفته فعال&lrm; شده، تکثیر می‌یابند و توکسین آلفا و بتا را ترشح می‌کنند. این توکسین‌ها از نواحی از کبد آسیب&lrm;دیده گسترش می‌یابند، از طریق جریان خون به اندام‌های حیاتی بدن وارد شده، و در نهایت مرگ دام را به&lrm;دنبال خواهد &lrm;داشت. بیماری قانقاریای عفونی کبد با خسارات اقتصادی شامل هزینه‌های مرگ و میر گوسفندان، استهلاک مزارع درگیر و مشکلات بهداشتی لاشه‌های آلوده همراه است که تشخیص و جداسازی عامل بیماری با روش‌های مرسوم وقت‌گیر است، لذا نیاز به یک روش ساده و سریع برای جداسازی و تشخیص کلستریدیوم نووئی وجود دارد. بنابراین، این مطالعه با هدف شناسایی مولکولی آلفا توکسین در جدایه‌های ایرانی کلستریدیوم نووئی از کبد گوسفند انجام&lrm;گرفت. مواد و روش&lrm;ها: در این مطالعه، تعداد 62 نمونه‌ کبد مشکوک به بیماری قانقاریای عفونی کبد (دارای مناطق نکروزه و انگلی) از کشتارگاه‌های ایران (مرند 5، اهواز 8، شهریار 13 و ایلام 36 نمونه) طی سه ماه پایانی سال 1398 و سه ماه ابتدایی سال 1399 جمع‌آوری شدند. برای جداسازی باکتری، ابتدا تکه‌هایی از قسمت‌های مختلف کبد جدا شدند و سلایه گردیدند و با انجام سانتریفیوژ، مایع‌رویی به&lrm;عنوان عصاره جمع‌آوری شد. تکه‌های برداشت شده از کبد در محیط کشت مایع جگر (chopped liver broth) کشت داده شدند و در شرایط بی‌هوازی، گرم‌خانه‌گذاری گردیدند. برای تایید مولکولی، DNA نمونه‌های عصاره بافت با روش فنل-کلروفرم و DNA نمونه‌های کشتداده شده با استفاده از کیت، استخراج گردیدند. جدایه‌ها با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی آلفا توکسین، بررسی شدند. جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن‌ها تشخیص داده شد، جهت تأیید براساس توالی 16S rDNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر ‌گردید. جهت جداسازی باکتری، کشت نمونه‌های مثبت بر روی محیط بویون جگر انجام و در شرایط بی‌هوازی قرار گرفت. جهت از بین بردن باکتری‌های غیر اسپوردار (خالص کردن باکتری)، محیط کشت به&lrm;مدت 10 دقیقه در °C 100 حرارت داده شد. سپس، عصاره بر روی محیط آگار خون‌دار کشت داده شد و پرگنه‌هایی که همولیز دادند، در محیط فرمانتور غنی جهت افزایش رشد و توکسین‌زایی کشت داده شدند. باکتری با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم جهت کنترل گرم مثبت و منفی بودن باکتری و رنگ آمیزی مالاشیت گرین جهت بررسی شکل و نوع اسپور مورد ارزیابی قرار گرفت. ژن توکسین آلفا در جدایه‌های مثبت تعیین توالی گردید و ردیف‌های نوکلئوتید ژن توکسین آلفا در این جدایه‌ها با توالی‌های هم&lrm;ارز جدایه‌ها و سویه‌های واکسن که پیش از این تعیین توالی ژنومی شده و در بانک ژن ثبت گردیده‌اند، مقایسه شدند. یافته‌ها: تخم انگل، پس از برش  تکه‌های کبد مشکوک و دارای آلودگی انگلی در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. پس از گرم‌خانهگذاری در شرایط بی‌هوازی، با رشد باکتری، کلنی‌های باکتری با اشکال نامنظم با حاشیه‌های نامشخص (پلی‌مورف) بر روی محیط آگار و رشد در محیطegg yolk  آگار ظاهر شدند و باکتری‌های گرم مثبت، میله‌ای، شکل دهنده اندوسپور در رنگآمیزی شناسایی شدند. با انجام PCR برای توکسین آلفا، باندی در محدوده 609 جفت باز ایجاد گردید و مشخص شد که هفت نمونه‌ به کلستریدیوم نووئی تعلق داشتند. نتایجPCR  با استفاده از آغازگرهای مربوط به ژن توکسین آلفا که در تیپ‌ B کلستریدیوم نووئی وجود دارد، نشان دادند که از 62 جدایه مشکوک به کلستریدیوم نووئی، هفت جدایه واجد ژن فوق بودند. در ضمن، همه عصاره‌های کبد منفی بودند و نمونه‌های مثبت همگی مربوط به نمونه&lrm;های کشت بودند. صحت جدایه‌هایی که وجود ژن توکسین آلفا در آن&lrm;ها تشخیص داده شد، با PCR-16S rDNA تایید شد. با انجام تعیین توالی برخی از جدایه‌هایی که وجود ژن آلفا توکسین کلستریدیدم نووئی در آن&lrm;ها تشخیص داده شده بود، شباهت بالایی با ساختار ژنومی آلفا&lrm;توکسین در میان جدایه‌ها و سویه واکسن وجود داشت. نتیجه‌گیری: جداسازی و شناسایی کلستریدیوم نووئی به&lrm;ندرت موفقیت&lrm;آمیز است زیرا باید نمونه تحت شرایط سخت بی‌هوازی سریع به آزمایشگاه منتقل شوند. علاوه &lrm;بر این، به&lrm;علت ماهیت بی‌هوازی باکتری، تشخیص و جداسازی کلستریدیوم نووئی به&lrm;سختی امکان&lrm;پذیر است. به&lrm;همین دلیل، گزارشات بیماری قانقاریای عفونی کبد معمولاً تشخیص احتمالی مبتنی &lrm;بر آسیب‌شناسی بافتی، آنتی‌بادی فلورسنت یا ایمنوهیستوشیمی هستند. تیپ کلستریدیوم نووئی به&lrm;سختی تعیین می‌شود. با توجه به این&lrm;که مهم&lrm;ترین فاکتور بیماریزایی کلستریدیوم نووئی تیپ B توکسین آلفا است، لذا جهت شناسایی جدایه به&lrm;روش مولکولی از آغازگر ژن توکسین آلفا استفاده شد. یافته‌های مطالعه حاضر نشان میدهند که روش PCR می&lrm;تواند با شناسایی توکسین آلفا در تشخیص کلستریدیوم نووئی جدایه‌ها کمک کند. در جمع‌بندی یافته‌ها، با توجه محدودبودن اطلاعات موجود در ایران از آلودگی گله‌های گوسفند نسبت به کلستریدیوم نووئی و تأیید مولکولی و شناسایی جدایه‌های بومی‌، انجام تحقیقاتی نظیر مطالعه حاضر در آینده می‌تواند به کنترل بیماری و کاهش خسارت‌های احتمالی آن در صنعت دامپروری ایران کمک کند و همچنین جداسازی جدایه ایرانی و ذخیره در مجموعه میکروبی کشور مفید است.</div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: Clostridium novyi type B bacteria cause infectious gangrene in the liver (black disease) of sheep and goats. This bacterium produces a cytotoxin called alpha toxin. The spores of this bacterium enter the body of the animal through the digestive system and penetrate the liver. If the necessary conditions for bacterial growth are provided, including hypoxia and liver damage, such as the migration of parasite larvae, latent spores are activated, multiply, and secrete alpha and beta toxins. These toxins spread from the affected areas of the liver, are absorbed into the bloodstream, enter the vital organs of the body, and eventually lead to the death of the animal. Infectious gangrene in the liver is associated with economic losses, including the costs of sheep deaths, depreciation of affected farms, and health problems of infected carcasses. It is time-consuming to diagnose and isolate the cause of the disease with conventional methods; thus, there is a need for a simple and fast method to isolate and diagnose C. novyi. Therefore, this study was conducted for the molecular identification of alpha toxin in Iranian isolates of C. novyi from sheep liver. Methods: In this study, 62 liver samples suspected of infectious liver gangrene (with necrotic and parasitic areas) were collected from Iranian slaughterhouses (Marand 5, Ahvaz 8, Shahryar 13, and Ilam 36 samples) during the last three months of 2018 and in the first three months of 2019. To isolate the bacteria, pieces from different parts of the liver were first separated and smeared, and the supernatant was collected as an extract by centrifugation. The pieces harvested from the livers were cultured in chopped liver broth and incubated under anaerobic conditions. For molecular confirmation, the DNA of the tissue extract samples was extracted using the phenol-chloroform method, and the DNA of the cultured samples was extracted using a kit. The isolates were investigated by the polymerase chain reaction (PCR) using alpha toxin-specific primers. Isolates in which the alpha toxin gene of Clostridium difficile was detected were amplified based on the 16S rDNA sequence using specific primers. To isolate bacteria, positive samples were cultured in liver broth and placed under anaerobic conditions. To destroy non-spored bacteria (cleaning bacteria), the medium was heated at 100 °C for 10 min. Then, the extract was cultured on a blood agar medium, and the hemolytic colonies were cultured in a rich fermenter medium to increase growth and toxin production. Bacteria were evaluated using Gram staining to control Gram-positive and Gram-negative bacteria and by malachite green staining to determine the shape and type of spores. The alpha toxin gene was sequenced in positive isolates, and the nucleotide sequences of the alpha toxin gene in these isolates were compared with the equivalent sequences of isolates and vaccine strains that were previously sequenced and registered in GenBank. Results: After cutting suspicious pieces of the liver with parasite contamination, parasite eggs were observed under a microscope. After incubation under anaerobic conditions, bacterial colonies with irregular shapes and unclear margins (polymorph) appeared on the agar medium and grew in the egg yolk agar medium, and Gram-positive, rod-shaped, endospore-forming bacteria were identified by staining. By performing PCR for the alpha toxin, a band was created in the range of 609 bp, and it was determined that seven samples belonged to C. novyi. PCR results using primers related to the alpha toxin gene present in type B C. novyi showed that out of 62 isolates suspected to be C. novyi, seven isolates contained the above gene. In addition, all liver extracts were negative, and the positive samples were all related to culture samples. The authenticity of the isolates in which the alpha toxin gene was detected was confirmed using PCR-16S rDNA. Sequencing of some of the isolates in which the alpha toxin gene of C. novyi was detected revealed a high similarity with the alpha toxin genomic structure among the isolates and the vaccine strain. Conclusion: Isolation and identification of C. novyi are rarely successful because the samples must be transported to the laboratory under strict anaerobic conditions. In addition, because of the highly anaerobic nature of the bacteria, it is difficult to detect and isolate C. novyi. For this reason, reports of infectious gangrene in the liver are usually a possible diagnosis based on tissue pathology, fluorescent antibodies, or immunohistochemistry. C. novyi was difficult to determine. Considering that the most important pathogenic factor of C. novyi type B is alpha toxin, the alpha toxin gene primer was used to identify the isolate using molecular methods. The findings of the present study show that PCR can help in the diagnosis of C. novyi isolates by identifying alpha toxin. In summary, considering the limited information available in Iran about the contamination of sheep flocks with C. novyi and molecular confirmation and identification of local isolates, conducting research such as the present study in the future can help control the disease and reduce its possible losses in the Iranian animal husbandry industry. It is also useful for isolating Iranian isolates and storing them in the microbial collection in the country. </div> α-توکسین, جداسازی, کلستریدیوم نووئی, PCR Clostridium novyi, Isolation, PCR, α-toxin 138 145 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1849-1&slc_lang=fa&sid=1 Anahita Emadi آناهیتا عمادی anahita_vet183@yahoo.com 100319475328460024866 100319475328460024866 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه پاتوبیولوژی، دانشکده علوم دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران Seyed Ali Pourbakhsh سید علی‌ پور بخش poursaba@yahoo.com 100319475328460024867 100319475328460024867 No Agricultural Research, Education and Extension Organization Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران Mohsen Fathi Najafi محسن فتحی‌نجفی najafi99@yahoo.com 100319475328460024868 100319475328460024868 Yes Education and Extension Organization Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران Mahmood Jamshidian محمود جمشیدیان m.b9854@yahoo.com 100319475328460024869 100319475328460024869 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه پاتوبیولوژی، دانشکده علوم دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران Kiumars Amini کیومرث امینی dr_kumarss_amini@yahoo.com 100319475328460024870 100319475328460024870 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه پاتوبیولوژی، دانشکده علوم دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران