Research on Animal Production

fa مطالعه امکان ارتباط مولکولی بین زنبور عسل و گیاه آفتابگردان از طریق انتقال بین گونه‎ ای RNA‎های کوچک A Study on the Possibility of Molecular Communication between Honey Bees and Sunflower through the Interspecies Transfer of Small RNAs تخصصي Special پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: زنبورعسل افزون بر تولید محصولات گوناگون مهمترین نقش خود را در طبیعت با دخالت در عمل گرده &lrm;افشانی و افزایش تولید محصولات کشاورزی و احیای محیط زیست ایفا می &lrm;کند، به&lrm; طوری&lrm;که تقریباً یک سوم تولید منابع غذایی بشر مستقیم یا غیرمستقیم به گرده&lrm; افشانی حشرات (زنبورعسل در رأس آنها) بستگی دارد. همچنین بررسی&lrm; ها نشان می&lrm; دهد که در کشورهای مختلف، نقش زنبورعسل در افزایش تولیدات کشاورزی 69 تا 143 برابر تولیدات مستقیم آن می&lrm; باشد. با گذشت بیش از یک دهه از شروع مطالعات مربوط به انتقال غذایی miRNAها بین موجودات مختلف و نقش تنظیمی آن&lrm;ها در موجود میزبان، این بحث همچنان داغ و به&lrm; روز می &lrm;باشد. به&lrm; طوری&lrm;که مطالعات محدودی در مورد نقش مصرف خوراکی miRNAها در زنبورعسل به&lrm; عنوان یک گرده&lrm; افشان مهم در صنعت کشاورزی و اکوسیستم طبیعی انجام شده است. امکان تنظیم بیان ژن بین گونه &lrm;های مختلف از طریق miRNAهای خوراکی، می &lrm;تواند سود ویژه &lrm;ای در رابطه متقابل گیاهان و گرده &lrm;افشان&lrm; های آن&lrm;ها داشته باشد به &lrm;طوری&lrm;که گیاهان می&lrm; توانند بیان ژن حشرات گرده &lrm;افشان را از طریق انتقال RNAهای کوچک کنترل کنند. به بیان دیگر، miRNAها نه&lrm; تنها بین سلول&lrm; ها و بافت &lrm;های یک ارگانیسم، بلکه بین گونه&lrm; های مختلف نیز قابلیت انتقال داشته و همچنان عملکرد تنظیمی خود را حفظ می&lrm; کنند. با توجه به نقش حیاتی زنبورعسل در گرده &lrm;افشانی گیاهان، این حشره می&lrm; تواند به &lrm;عنوان مدل بهتری در این زمینه مطرح شود. بدین&lrm; منظور، مطالعه حاضر که با هدف بررسی وجود ارتباط مولکولی بین این حشره مفید اجتماعی و گیاه میزبان از طریق انتقال غذایی miRNAهای با منشأ خارجی بوده، می&lrm; تواند ابعاد جدید و گسترده&lrm;ای از اثرات مفید این ارتباط را روشن کند. مواد و روش&lrm; ها: جمع &lrm;آوری گرده توسط تله گرده از کندوهای زنبورعسل واقع در مزرعه آفتابگردان در منطقه شال قزوین-ایران در روزهای اوج گلدهی گیاه مزبور انجام گرفت. گرده جمع &lrm;آوری شده بلافاصله از لحاظ مورفولوژیکی بررسی و به&lrm; منظور حفظ تازگی و جلوگیری از تخریب RNA، به تانک ازت مایع منتقل شد. به&lrm; منظور انجام آزمایشات تغذیه&lrm; ای از چهار عدد کندو برای جمع‌‌آوری زنبور پرستار و تغذیه تحت شرایط کنترل شده استفاده شد. بدین&lrm; ترتیب حدود صد عدد زنبور جوان از هرکدام از کندوها به داخل قفس‌‌های مخصوص طراحی شده، منتقل شد. دو عدد از قفس‌‌ها به&lrm; عنوان شاهد (تغذیه با شربت شکر) و دو قفس به &lrm;عنوان تیمار تغذیه شده با گرده آفتابگردان در نظر گرفته شد. همچنین برای برقراری شرایط طبیعی کندو (فرمون ملکه، دما و رطوبت) در حین آزمایش، قفس&lrm;ه ای حاوی زنبورهای پرستار در طبقه بالای کندو قرار داده شد. به&lrm; منظور شستشوی دستگاه گوارش زنبور، همه تیمارها به &lrm;مدت 48 ساعت با شربت شکر تغذیه شده، بعد از آن برای تشویق تغذیه بعدی حدود 3 ساعت زنبورها گرسنه نگه داشته شدند و در 24 ساعت بعدی تیمار شاهد همچنان با شربت شکر و تیمار بعدی با محلول 30 درصد شکر و 70 درصد گرده آفتابگردان تغذیه شد. بعد از اتمام آزمایشات تغذیه&lrm; ای، زنبوران با استفاده از سرما بیهوش شده و بافت روده میانی آن&lrm;ها جمع &lrm;آوری و در ترایزول هموژنیزه شده و در دمای منفی هشتاد درجه سانتی &lrm;گراد تا زمان استخراج ذخیره گردید. استخراج RNA از گرده و بافت روده میانی زنبورعسل با استفاده از کیت miRNeasy mini Kit از شرکت کیاژن انجام گرفت و نمونه &lrm;ها برای توالی&lrm; یابی به شرکت Novogene بیجینگ چین فرستاده شد. بعد از توالی &lrm;یابی موفیت &lrm;آمیز Small RNA-Seq، با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی، miRNAهای گرده آفتابگردان شناسایی و ردیابی آن&lrm;ها در زنبورهای گروه&lrm;های مختلف تغذیه شده انجام گرفت. در گام بعد، از تکنیک RT-qPCR برای تأیید نتایج حاصل از آنالیز بیوانفورماتیکی، استفاده شد. یافته &lrm;ها: نتایج آنالیز بیوانفورماتیکی حاکی از ردیابی یازده miRNAی گیاهی (miR-148a، miR-26a، miR-21-5p، miR-143، miR-27a، miR-203، let-7g، miR-126، miR-30d، miR-101 و miR-103) در زنبوران تغذیه شده با گرده آفتابگردان بود در حالی&lrm;که در زنبوران گروه کنترل هیچ miRNA گیاهی یافت نشد. برای راستی آزمایی نتایج حاصل از آنالیز بیوانفورماتیکی، به&lrm; طور تصادفی الگوی بیان چهار مورد از miRNAهای منتقل شده (let-7g، miR-21-5p، miR-126 و148 miR-) با روش RT-qPCR تأیید شد که نشانگر نقش احتمالی miRNAهای گیاهی ردیابی شده در تنظیم بیان ژن زنبورعسل می&lrm; باشد. نتیجه&lrm; گیری: این یافته‌ها شواهد قانع‌کننده‌ای را برای انتقال موفق میکروRNAها (miRNAها) از گیاه میزبان به بدن زنبورهای عسل از طریق رژیم غذایی ارائه می‌دهند. این پدیده به ارتباطات پیچیده بین زنبورهای عسل و گیاهانی که گرده‌افشانی می‌کنند، تأکید می‌کند و نقش حیاتی زنبورهای عسل در حفظ سلامت اکوسیستم و تولیدات کشاورزی را برجسته می‌سازد. بحث جاری درباره انتقال رژیمی &lrm;miRNAهای گیاهی در گونه‌های مختلف، پتانسیل نقش‌های تنظیمی آن‌ها در تأثیرگذاری بر بیان ژن در موجودات میزبان را نشان می‌دهد. کشف یک رابطه مولکولی بین زنبورهای عسل و گیاهان میزبان از طریق miRNAها، راه‌های جدیدی را برای درک تعاملات پیچیده‌ای که در اکوسیستم‌ها رخ می‌دهد، به&lrm; ویژه بین حشرات گرده‌افشان و گیاهان گلدار، باز می‌کند. با پیشرفت بیشتر در ابعاد گسترده این رابطه مولکولی، به‌طور فزاینده‌ای روشن می‌شود که این تعاملات می‌توانند به‌عنوان یک نقشه راه برای مطالعات آینده عمل کنند. چنین تحقیقاتی می‌تواند بر روی افزایش تولید کندو از طریق پرورش انتخابی گیاهانی که مزایای تغذیه‌ای و ژنتیکی را برای زنبورهای عسل بهینه می‌کنند، متمرکز شود. علاوه بر این، درک اینکه چگونه این miRNAهای منتقل‌شده بر سیستم ایمنی زنبورهای عسل تأثیر می‌گذارند، ممکن است منجر به توسعه استراتژی‌های بهبودی برای مقاومت در برابر بیماری‌ها شود که در نهایت به نفع هر دو جمعیت زنبور و شیوه‌های کشاورزی وابسته به خدمات گرده‌افشانی آن‌ها خواهد بود.  </div> <div style="text-align: justify;">Extended Abstract Background: Honeybees play a crucial role in nature, primarily through their involvement in pollination, which significantly enhances agricultural productivity and contributes to environmental restoration. It is estimated that nearly one-third of global food production is directly or indirectly reliant on insect pollination, with honeybees being the most prominent among them. Studies indicate that the contribution of honeybees to agricultural output in various countries is 69-143 times greater than their direct production. Over a decade has passed since the initiation of research on the interspecies transfer of dietary microRNAs (miRNAs) and their regulatory roles in host organisms, yet this topic remains vibrant and current. Limited studies have been conducted on the role of dietary miRNAs in honeybees, which are critical pollinators in agricultural industries and natural ecosystems. The potential for gene expression regulation among different species via dietary miRNAs could provide significant benefits in the interactions between plants and their pollinators, allowing plants to modulate the gene expression of pollinating insects through small RNA transfer. In other words, miRNAs can be transferred not only between cells and tissues within an organism but also across different species while maintaining their regulatory functions. Given the vital role of honeybees in plant pollination, this insect may serve as a more suitable model for studying these interactions. Therefore, the present study aims to investigate the molecular relationship between this beneficial social insect and its host plants through the dietary transfer of exogenous miRNAs, potentially illuminating new and extensive dimensions of the beneficial effects of this interaction. Methods: Pollens were collected using pollen traps from honeybee hives located on a sunflower farm in the Shal region of Qazvin, Iran, during thepeak flowering days of the plant. The collected pollens were immediately examined morphologically and transferred to liquid nitrogen tanks to preserve freshness and prevent RNA degradation. For nutritional experiments, four hives were utilized to gather nurse bees under controlled conditions. Approximately 100 young bees from each hive were transferred into specially designed cages. Two cages served as controls (fed with sugar syrup) while the two others were treated with sunflower pollens. To maintain natural hive conditions (queen pheromone, temperature, and humidity) during the experiment, the cages containing nurse bees were placed on the upper level of the hive. To cleanse the digestive system of the bees, all treatments were fed with sugar syrup for 48 h. Subsequently, to encourage further feeding, the bees were kept hungry for about 3 h. In the following 24 h, the control group continued receiving sugar syrup while the treatment group was fed a solution consisting of 30% sugar and 70% sunflower pollen. After completing the nutritional experiments, the bees were anesthetized using cold temperatures, and their midgut tissues were collected, homogenized in Trizol, and stored at -80 °C until extraction. RNA from both pollen and honeybee midgut tissues was extracted using a miRNeasy mini Kit from Qiagen, and samples were sent to Novogene in Beijing, China, for sequencing. Following successful Small RNA-Seq sequencing, bioinformatics analyses were conducted to identify sunflower-derived miRNAs and track their presence in bees from different feeding groups. Subsequently, RT-qPCR was employed to validate results obtained from bioinformatics analyses. Results: The results of bioinformatics analysis indicated the identification of 11 plant miRNAs (miR-148a, miR-26a, miR-21-5p, miR-143, miR-27a, miR-203, let-7g, miR-126, miR-30d, miR-101, and miR-103) in honeybees fed with sunflower pollen while no plant miRNAs were found in the control group of bees. To validate the results obtained from the bioinformatics analysis, the expression patterns of four randomly selected transferred miRNAs (let-7g, miR-21-5p, miR-126, and miR-148) were confirmed using RT-qPCR, indicating a potential regulatory role for the identified plant miRNAs in honeybee gene expression. Conclusion: These findings provide compelling evidence for the successful transfer of miRNAs from the host plant to the body of honeybees through dietary means. This phenomenon highlights the intricate connections between honeybees and the plants they pollinate, emphasizing the vital role that honeybees play in maintaining ecosystem health and agricultural productivity. The ongoing discussion regarding the dietary transfer of plant miRNAs across various species underscores their potential regulatory roles in influencing gene expression within the host organism. The discovery of a molecular relationship between honeybees and their host plants via miRNAs opens new avenues for understanding the complex interactions that occur in ecosystems, particularly between pollinating insects and flowering plants. As we delve deeper into the extensive dimensions of this molecular relationship, it becomes increasingly clear that these interactions could serve as a roadmap for future breeding studies. Such research could focus on enhancing hive production through selective breeding of plants that optimize the nutritional and genetic benefits for honeybees. Additionally, understanding how these transferred miRNAs influence the immune systems of honeybees may lead to improved strategies for disease resistance, ultimately benefiting both bee populations and agricultural practices reliant on their pollination services.  </div> <div style="text-align: justify;"></div><div style="text-align: justify;"></div> انتقال غذایی miRNA, زنبورعسل, گرده آفتابگردان, RT-qPCR Diet-derived transmission of MicroRNAs, Honey bees, RT-qPCR, Sunflower pollen 117 128 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1829-1&slc_lang=fa&sid=1 Leila Gharehdaghi لیلا قره داغی l.gharedaghi@areeo.ac.ir 100319475328460023886 0009-0009-7953-6177 Yes Department of Animal Science Research, East Azerbaijan Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, AREEO, Tabriz, Iran, بخش تحقیقات علوم دامی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی آذربایجان شرقی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تبریز، ایران Gholamhosein Tahmasbi غلامحسین طهماسبی tahmasbigholamhosein@gmail.com 100319475328460023887 100319475328460023887 No Department of Honey Bee, Animal Science Research Institute of Iran, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran بخش تحقیقات زنبور عسل، مؤسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران Taher Harkinezhad طاهر هرکی نژاد taher.harkinezhad@znu.ac.ir 100319475328460023888 100319475328460023888 No Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran گروه علوم دامی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران