Research on Animal Production

fa تولید اولین پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) Production of the First Effective Immune Equine Serum Antivenom against Iranian Honey Bees (Apis mellifera meda) مدیریت دامپروری و تولید مدیریت دامپروری و تولید پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">چکیده مبسوط مقدمه و هدف: زهر زنبور عسل ترکیبی مایع، بیرنگ و اسیدی (pH 4.5–5.5) است که شامل 18 ترکیب متفاوت مانند آنزیم ها، پپتیدها و آمینه ای زیستی می باشد. برخی از این ترکیبات دارای خواص ضد التهابی و برخی دارای خواص سمی و آلرژن می‌باشد. مهم ترین پپتیدهای موجود در زهر زنبور ملیتین، آپامین، آدولاپین و پپتید دگرانوله کننده ماست سل هستند. مهمترین آنزیم‌های موجود در زهر زنبور می‌توان هیالورونیداز و فسفولیپاز A2 را نام برد. زهر زنبور عسل در ادوار گذشته بخصوص در درمان سنتی همواره به&lrm;عنوان دارو در درمان بیماری&lrm;های مختلفی مانند آرتریت روماتویید و همچنین جهت کاهش دردهای عضلانی مورد استفاده قرار گرفته است. زنبورگزیدگی به&lrm;عنوان یکی از مشکلات در سیستم بهداشت عمومی برخی از کشورهای دنیا از جمله ایران مطرح می‌باشد. در حال حاضر درمان خاصی برای زنبور گزیدگی وجود ندارد و درمان تا حدودی توسط داروهای شیمیایی انجام می‌شود. در سال‌های گذشته پادزهر مبتنی بر Fab از اسب و گوسفند به&lrm;عنوان یک درمان جدید بالقوه مطرح شده است. تاکنون در ایران اقدامی جهت تولید آنتی‌ونوم (پادزهر) برای نجات افراد حساس به نیش زنبور صورت نگرفته است. لذا هدف از این تحقیق تولید پادزهر سرم اسبی موثر و ایمن در مقابل زنبور عسل ایرانی (Apis mellifera meda) بود.  مواد و روش&lrm;ها: زهر خام از زنبور عسل ایرانی به&lrm;وسیله دستگاه زهرگیر تهیه گردید. زهر در مجاورت هوا سریعاً خشک می‌شود. زهر خشک شده هر روز به&lrm;کمک کاردک‌های مخصوص از روی صفحات شیشه‌ای جمع&lrm;آوری و برای استفاده بعدی در شیشه‌های تیره رنگ در فریزر 20- درجه سانتی گراد ذخیره گردید. به&lrm;هنگام استفاده از سم، برای حذف موکوس و مواد اضافه، سم به نسبت 1 به 1 با محلول سالین (سرم فیزیولوژی) حل شده و با دور بالا سانتریفیوژ می‌گردد. بعد از سانتریفیوژ محلول شفاف بالایی جدا و با فیلتر 0/2 میکرون فیلتر می‌گردد. مقدار پروتئین موجود در محلول زهر خام، به&lrm;روش پروتئین سنجی برادفورد و بر اساس منحنی استاندارد حاصل از سنجش غلظت‌های مختلف محلول سرم آلبومین گاوی (BSA) تعیین شد. مقدار متوسط دوز کشندگی (LD50) با 24 موش سوری نر تعیین گردید. موش‌ها به گروه‌های 4 تایی تقسیم شدند و 0/5 میلی‌لیتر از دوزهای مختلف زهر (60، 70، 80، 90، 100 و 110 میکروگرم در میلی‌لیتر) محلول در نرمال سالین استریل به&lrm;صورت داخل وریدی به آنها تزریق شد. به موش‌های شاهد 0/5 میلی‌لیتر محلول نمکی تزریق شد. مرگ و میر پس از 24 ساعت ثبت شد و LD50 بر اساس آنالیز پروبیت محاسبه گردید. در این پژوهش از 3 اسب مادیان بالغ 3 ساله (400 تا 450 کیلوگرم) استفاده گردید. برای ایمن سازی اسب‌ها زهر زنبور به همراه ادجوانت فروند کامل و ناقص تزریق گردید. در تلقیح اول و دوم از ادجوانت فروند کامل و در تلقیح‌های بعدی از ادجوانت فروند ناقص استفاده شد. تلقیح سم به صورت افزایشی به ترتیب از 50، 100، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 میکروگرم در طی 7 مرتبه با فواصل زمانی 7 روز اجرا شد. تزریق به صورت زیر پوستی (گردن) انجام شد. جداسازی آنتی بادی اسب با پروتکل استاندارد روش آمونیوم سولفات اشباع شده اجرا شد. ارزیابی ایمنی‌زایی در شرایط آزمایشگاهی  با تست الایزا انجام گرفت. سرم اسب‌های ایمن شده و نیز آنتی‌ونوم حاصل از رسوب آمونیوم سولفات اشباع از نظر خنثی‌سازی سم ارزیابی شدند. جهت بررسی کیفیت پادزهر، خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر اجرا شد. در نهایت متوسط دوز موثر (ED50) برای پادزهر در موش سوری تعیین گردید. برای تعیین کارآیی پادزهر اسبی تهیه شده، زهر زنبور به&lrm;صورت دوز افزایشی با مقدار ثابت پادزهر مخلوط و به موش تزریق شد. یافته&lrm;ها: مقدارLD50 برای زهر زنبور 4/84 میکروگرم برای هر گرم وزن زنده موش به&lrm;دست آمد. نتایج تست الیزا نشان داد که روند پاسخ اسب‌ها نسبت به زهر افزایشی بوده و به&lrm;خوبی با آنتی ژن ایمن شده&lrm;اند. خنثی‌سازی فعالیت فسفولیپاز A2 با استفاده از غلظت‌های مختلف پادزهر نشان داد که سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و 120 میکروگرم در میلی‌لیتر از این پادزهر قادر به خنثی‌کردن کامل فعالیت سم فسفولیپاز A2 است. از این داده‌ها مشخص است که اولاً سم زنبور عسل ایرانی دارای فعالیت فسفولیپازی است و دوماً 55 میکروگرم پادزهر برای خنثی‌کردن 50 درصدی فعالیت فسفولیپاز A2 در 100 میکروگرم زهر مورد نیاز است. مقدار ED50 تقریباً 54 برابر LD50 خواهد شد. این بدان معنی است که پادزهر تا 54 برابر LD50 را می‌تواند خنثی کند. بنابراین مرگ ایجاد شده بوسیله 4 میلی‌گرم سم زنبور با 1 میلی‌لیتر پادزهر خنثی می‌شود به&lrm;همین دلیل میزان متوسط دوز موثر ED50 برابر با 4 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر خواهد بود. اگر در هر بار نیش زنبور مقدار 100 میکروگرم زهر وارد بدن شود پس 1 میلی‌لیتر از این پادزهر می‌تواند 40 نیش زنبور را خنثی کند. نتیجه‌گیری: پادزهر سرم اسبی که علیه سم زنبور عسل ایرانی به&lrm;دست آمد، در مدل حیوانی قادر به خنثی سازی سم بوده و از مرگ موش&lrm;هایی که با سم تلقیح شده بودند جلوگیری می‌نماید. </div> <div style="text-align: justify;"> <div style="text-indent: -0.5pt;">Extended Abstract </div> <div>Background: Bee venom is a colorless, acidic liquid (pH 4.5-5.5) that contains 18 different compounds, including enzymes, peptides, and biological amino acids. Some of these compounds have anti-inflammatory properties, while others possess toxic and allergenic properties. Bee venom is produced by female worker bees, with the most important peptides being melittin, apamin, adolapin, and mast cell degranulating (MCD) peptide. The key enzymes in bee venom include hyaluronidase and phospholipase A2 (PLA2). Historically, bee venom has been used in traditional medicine to treat various diseases, such as rheumatoid arthritis, and to alleviate muscle pain. Massive bee attacks are considered a public health problem in several countries, including Iran. Currently, no specific therapy exists for bee stings; treatment typically involves chemical drugs. This has led us to explore the development of Fab-based antivenom as a potential new treatment. To date, no efforts have been made in Iran to produce Fab-based antivenom for individuals sensitive to bee stings. Therefore, this research aimed to produce an effective and safe horse serum antidote against the Iranian honey bee (Apis mellifera meda). Methods: Crude bee venom (BV) was collected from Iranian bees (Apis mellifera meda) using an electric bee venom-collecting machine. The venom dries quickly in the air; therefore, it was collected daily from glass plates using special spatulas and stored in dark glass containers in a freezer at -20 ºC for future experiments. To remove mucus and extraneous substances, the venom was dissolved in a 1:1 ratio with saline (physiological serum) and centrifuged at high speed. After centrifugation, the upper clear solution was separated and filtered using a 0.2-micron filter. The protein concentration in the crude venom solution was determined using the Bradford protein assay method, based on a standard curve obtained from different concentrations of bovine serum albumin (BSA) solution. The median lethal dose (LD50) of BV was determined using 24 male mice, which were divided into four groups. Different doses of venom (60, 70, 80, 90, 100, and 110 μg/ml) dissolved in sterile normal saline were injected intravenously. The control group received 0.5 ml of saline solution. Mortality was recorded after 24 hours, and LD50 was calculated using probit analysis. Three horses were used to produce antivenom against honey bee venom. The horses were immunized with Iranian bee venom seven times at 7-day intervals, and immunogenicity was evaluated under laboratory conditions using the ELISA test. The precipitated antivenom with saturated ammonium sulfate was used to perform the neutralizing test in mice. To assess the quality of the antivenom, the neutralization of phospholipase A2 activity was tested with different concentrations of antivenom. Finally, the median effective dose (ED50) was calculated using probit analysis. Three adult mares (three years old, weighing 400 to 450 kg) were used for immunization. Bee venom was injected with complete and incomplete Freund's adjuvant; complete Freund's adjuvant was used in the first two inoculations, while incomplete Freund's adjuvant was used in subsequent ones. Venom doses were incrementally increased from 50, 100, 250, 500, 1000, 2000, to 4000 micrograms over seven inoculations at 7-day intervals, administered subcutaneously (in the neck). Horse antibody isolation was performed using the saturated ammonium sulfate method. Immunogenicity evaluation was conducted via the ELISA test. The serum from immunized horses and the precipitated antivenom were also used for neutralization tests in mice. The neutralization of phospholipase A2 activity was assessed with various concentrations of antivenom. The effectiveness of the prepared antivenom was determined by calculating the ED50 value through probit analysis. Results: The total protein concentration in the crude BV solution was calculated to be 56 mg/ml, and the LD50 of the crude BV was determined to be 4.84 μg/g. ELISA test results indicated an immune response that increased throughout the immunization schedule. Neutralization of phospholipase A2 activity with different concentrations of antivenom demonstrated that Iranian bee venom possesses phospholipase activity, and 120 μg/ml of this antidote can completely neutralize the activity of phospholipase A2. Furthermore, 55 micrograms of antivenom are required to neutralize 50% of phospholipase A2 activity in 100 micrograms of venom. The ED50 value is approximately 54 times the LD50, indicating that the antivenom can neutralize up to 54 times the LD50. Therefore, the death caused by 4 mg of bee venom can be neutralized by 1 ml of antivenom, resulting in an average effective dose (ED50) of 4 mg/ml. If 100 micrograms of venom enters the body with each bee sting, then 1 ml of the produced antivenom can neutralize 40 bee stings. Conclusion: The results indicate that horse antivenom against honey bee venom is capable of neutralizing crude venom in a mouse model.</div> <div></div></div> اسب, پادزهر, زنبور عسل ایرانی Antivenom, Equine, Iranian honey Bees 95 104 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1129-4&slc_lang=fa&sid=1 Mahmoud Nazari محمود نظری m.nazari@asnrukh.ac.ir 100319475328460022901 100319475328460022901 Yes Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان،ر ملاثانی، ایران Hedayatolah Roshanfekr هدایت اله روشنفکر roshanfekr_hd@yahoo.com 100319475328460022902 100319475328460022902 No Department of Animal Science, Faculty of Animal science and Food Technology, Agricultural Science and Natural Resources University of Khuzestan, Mollasani, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران Fatemeh Saalabi فاطمه ثعلبی f.salabi@rvsri.ac.ir 100319475328460022903 100319475328460022903 No Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz, Iran سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، اهواز، ایران Jamal Fayazi جمال فیاضی j_fayazi@yahoo.com 100319475328460022904 100319475328460022904 No Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz, Iran گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، ملاثانی، ایران Ali Mohammadian علی محمدیان fat_sa_2012@yahoo.com 100319475328460022905 100319475328460022905 No Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz, Iran سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، اهواز، ایران Fariba Kavosh فریبا کاوش fat_sa_2005@yahoo.com 100319475328460022906 100319475328460022906 No Department of Venomous Animals and Anti-venom Production, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Ahvaz-Iran سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی شعبه اهواز، گروه جانوران سمی و تولید پادزهر، اهواز، ایران