Research on Animal Production

fa بررسی شبکه ژن‌ها و miRNAهای تنظیم‌کننده در پاتوژنز ورم پستان گاو ناشی از Escherichia coliبه کمک تحلیل بیان ژنی ریزآرایه ای Investigation of Genes and Regulatory miRNAs Involved in the Pathogenesis of Bovine Mastitis Using Microarray Gene Expression Analysis ژنتیک و اصلاح نژاد دام ژنتیک و اصلاح نژاد دام پژوهشي Research چکیده مبسوط مقدمه و هدف: ورم پستان گاو ،  یکی از شایع‌ترین و پرهزینه‌ترین بیماری‌های عفونی در صنعت جهانی دام می باشد و سالانه موجب خسارات اقتصادی قابل‌توجهی از طریق کاهش تولید شیر، افت کیفیت ترکیبات شیر، افزایش هزینه‌های درمان، حذف زودهنگام دام و افزایش بار آنتی‌بیوتیکی می شود. این بیماری با پاسخ‌های التهابی شدید در غده پستانی همراه است که ناشی از تعامل پیچیده بین پاتوژن، سیستم ایمنی ذاتی و اکتسابی میزبان، و تنظیم ژنتیکی و فراژنتیکی مسیرهای مولکولی متعدد می‌باشد. در میان عوامل بیماری‌زا، اشرشیاکلی(E. coli) یکی از مهم‌ترین باکتری‌های مولد ورم پستان حاد است که با تحریک سریع مسیرهای التهابی، موجب تخریب بافتی و تغییرات گسترده در پروفایل بیان ژن می‌شود. پیشرفت فناوری‌های اُمیکس، به‌ویژه ریزآرایه‌ها (Microarray) و RNA‑seq، نشان داده است که ورم پستان سبب تغییر بیان در هزاران ژن مرتبط با ایمنی ذاتی، پاسخ التهابی، متابولیسم انرژی، چرخه سلولی و بازسازی بافت پستان می‌شود. با این حال، بسیاری از مطالعات پیشین، عمدتاً بر شناسایی ژن‌های متفاوت بیان تمرکز داشته‌اند و تحلیل ساختار شبکه‌ای ژن‌ها و نقش تنظیمی miRNAها که به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های پسارونویسی شناخته می‌شوند، به‌صورت یکپارچه مورد بررسی قرار نگرفته است. miRNAها با اتصال به mRNAهای هدف، قادرند به‌طور همزمان چندین مسیر سیگنال دهی ایمنی و متابولیک را تنظیم کنند و بدین ترتیب نقش کلیدی در تعیین شدت التهاب، تداوم پاسخ ایمنی و پیامدهای بافتی بیماری ایفا نمایند. از این رو، هدف اصلی پژوهش حاضر، شناسایی ژن‌های هاب و miRNAهای کلیدی مرتبط با پاتوژنز ورم پستان القاشده توسط E. coli در گاو شیری و بررسی نقش آن‌ها در تنظیم شبکه‌ای مسیرهای ایمنی، التهابی و متابولیکی با استفاده از یک رویکرد بیوانفورماتیکی مبتنی بر شبکه می‌باشد. مواد و روش‌ها: در این مطالعه، پروفایل بیان ژنی مربوط به نمونه های بافت غده پستانی  گاو مبتلا به ورم پستان ناشی از E-coli  ز پایگاه داده Gene Expression Omnibus (GEO) تحت شناسه GSE15020 استخراج گردید.تحلیل بیان ژن‌های متفاوت بیان با استفاده از ابزار GEO2R انجام شد و ژن‌ها بر اساس معیارهای آماری p-value <0.05 و ((|LogFC|>1  فیلتر شدند تا ژن‌های دارای تغییر بیان معنی‌دار شناسایی گردند. به‌منظور بررسی تعاملات مولکولی، شبکه برهم‌کنش پروتئین–پروتئین  (PPI) با استفاده از پایگاه داده STRING ساخته شد و سپس در محیط نرم‌افزار Cytoscape مورد تجزیه‌ و تحلیل قرار گرفت. شناسایی ژن‌های هاب شبکه با بهره‌گیری از افزونه cytoHubba و به‌کارگیری الگوریتم‌های Degree، MCC، MNC و DMNC انجام شد تا ژن‌هایی که بالاترین اهمیت توپولوژیک و نقش مرکزی در شبکه دارند، استخراج گردند. در ادامه، برای پیش‌بینی miRNAهای تنظیم‌کننده ژن‌های هاب، پایگاه داده miRWalk مورد استفاده قرار گرفت و miRNAهایی که به‌طور مشترک چندین ژن کلیدی را هدف قرار می‌دادند، انتخاب شدند. این رویکرد امکان ترسیم تعاملات ژن miRNA– و تفسیر نقش تنظیمی آن‌ها در مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با ورم پستان را فراهم نمود. یافته‌ها: نتایج تحلیل بیان متفاوت ژن‌ها منجر به شناسایی 1023 ژن با تغییر بیان معنی‌دار شد که از این میان 612 ژن افزایش بیان و 411 ژن کاهش بیان را نشان دادند. تحلیل شبکه PPI ده ژن هاب شامل GAPDH، ALB، CXCL8، IL1B، CCL2، EGFR، PTPRC، PARP12، IFITM3 و XAF1 را به‌عنوان اجزای مرکزی شبکه معرفی کرد. این ژن‌ها عمدتاً در مسیرهای کلیدی التهاب، سیگنالینگ کیموکاین‌ها، پاسخ ایمنی ذاتی، تنظیم چرخه سلولی و بقایا مرگ سلولی دخیل هستند. برای نمونه ، IL1B یکی از کلیدی‌ترین میانجی‌های تب و التهاب است و بعنوان یکی از مهم‌ترین سایتوکاین‌های پیش‌التهابی نقش اساسی در القای تب، نفوذپذیری عروقی و فعال‌سازی سلول‌های ایمنی ایفا می‌کند. CXCL8 با تنظیم جذب و فعال‌سازی نوتروفیل‌ها، در پاسخ ایمنی اولیه علیه عفونت باکتریایی نقش تعیین‌کننده دارد. همچنین ALB به‌عنوان یکی از ژن‌های هاب شناسایی شد، می‌تواند در قالب پروتئین‌های فاز حاد مثبت در شیر، به‌عنوان یک نشانگر زیستی بالقوه برای تشخیص ورم پستان مورد توجه قرار گیرد. تحلیل miRNAها منجر به شناسایی 45 miRNA مشترک شد که قادر به تنظیم همزمان چندین ژن هاب بودند. در میان آن‌ها، bta-miR-21-3p  با هدف قرار دادن EGFR و IL1B و تنظیم مسیر PI3K/AKT/NF‑κB نقش مهمی در تشدید پاسخ التهابی دارد.bta-miR-145  با مهار تکثیر سلول‌های اپی‌تلیال پستانی  (Mac‑T) و  تنظیم IL1B می‌تواند در تعادل بین التهاب و بازسازی بافت نقش ایفا کند. همچنین  bta-miR-138از طریق مهار مسیر p65/NF‑κB، بیان ژن‌های PARP12 و EGFR را تحت تأثیر قرار داده و در تنظیم پاسخ ایمنی ضدویروسی و التهابی مشارکت دارد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که miRNAها قادرند به‌صورت هماهنگ مسیرهای التهابی را فعال و مسیرهای متابولیکی مرتبط با عملکرد طبیعی غده پستانی را سرکوب نمایند. نتیجه‌گیری: ورم پستان گاو یک فنوتیپ پیچیده، چندعاملی و شبکه‌محور است که حساسیت یا مقاومت دام به آن حاصل برهم‌کنش دینامیک ژن‌ها، miRNAها و مسیرهای مولکولی متعدد می‌باشد. نتایج این مطالعه با بهره‌گیری از یک رویکرد بیوانفورماتیکی یکپارچه، ژن‌ها و miRNAهای کلیدی دخیل در پاتوژنز ورم پستان ناشی از E. coli را شناسایی نمود و نقش محوری مسیرهای ایمنی نظیر JAK/STAT، سیگنالینگ اینترفرون و NF‑κB، و همچنین مسیرهای متابولیکی و میتوکندریایی تحت تنظیم EGFR را برجسته ساخت. یافته‌های حاضر می‌توانند به‌عنوان مبنایی برای توسعه نشانگرهای مولکولی تشخیصی، طراحی ابزارهای پیش‌آگهی، و برنامه‌های اصلاح نژادی مبتنی بر مقاومت به ورم پستان در گاوهای شیری مورد استفاده قرار گیرند و درک عمیق‌تری از سازوکارهای مولکولی این بیماری شایع فراهم سازند. Extended abstract Introduction Bovine mastitis is one of the most common and costly infectious diseases affecting the global dairy industry and is responsible for considerable economic losses each year through reduced milk yield, compromised milk quality, increased treatment costs, premature culling, and extensive antibiotic use. The disease is characterized by pronounced inflammatory responses in the mammary gland, resulting from complex interactions between invading pathogens, the host innate and adaptive immune systems, and genetic and epigenetic regulatory mechanisms. Among mastitis‑associated pathogens, Escherichia coli is a major cause of acute mastitis and induces a rapid inflammatory response that leads to tissue damage and marked alterations in gene expression patterns. High‑throughput omics technologies, particularly microarray and RNA‑seq approaches, have demonstrated that mastitis is accompanied by extensive transcriptional reprogramming involving genes related to innate immunity, inflammation, energy metabolism, cell cycle control, and tissue remodeling. However, most previous studies have focused primarily on lists of differentially expressed genes, while the underlying gene interaction networks and the contribution of microRNAs (miRNAs) as post‑transcriptional regulators have received less attention. miRNAs are capable of simultaneously regulating multiple mRNA targets and, as a result, can modulate key immune and metabolic pathways that influence the intensity and progression of inflammatory responses. Therefore, the present study aimed to identify central hub genes and regulatory miRNAs involved in E. coli‑induced mastitis in dairy cows and to explore their roles within immune‑ and metabolism‑related molecular networks using an integrated bioinformatics framework. Materials and Methods Gene expression data from bovine mammary glands affected by Escherichia coli‑induced mastitis were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) database (accession number GSE15020). Differentially expressed genes were identified using GEO2R, applying a threshold of p < 0.05 and |LogFC| > 1 to ensure statistical significance. Protein–protein interaction (PPI) analysis was performed using the STRING database, and the resulting network was visualized and analyzed in Cytoscape. Hub genes were identified using the cytoHubba plugin based on multiple topological algorithms, including Degree, MCC, MNC, and DMNC, to increase confidence in hub selection. Subsequently, miRNAs targeting these hub genes were predicted using the miRWalk database, and miRNAs shared among multiple hub genes were retained for further analysis. This strategy enabled the construction of integrated gene–miRNA interaction networks and facilitated biological interpretation of the regulatory mechanisms involved in bovine mastitis. Results A total of 1,023 genes were identified as differentially expressed, including 612 upregulated and 411 downregulated genes following E. coli infection. PPI network analysis highlighted ten genes GAPDH, ALB, CXCL8, IL1B, CCL2, EGFR, PTPRC, PARP12, IFITM3, and XAF1as central hubs within the network. These genes are mainly associated with inflammatory signaling, chemokine‑mediated immune responses, regulation of cell survival, and immune cell activation. Among these hubs, IL1B represents a central mediator of fever and inflammation and is widely recognized as a major pro‑inflammatory cytokine involved in fever induction, increased vascular permeability, and activation of immune cells. CXCL8 plays a key role in neutrophil recruitment and activation and contributes substantially to the early immune response against bacterial infection. In addition, ALB, identified as a hub gene in the network, may have potential value as a milk‑based biomarker through its association with positive acute‑phase proteins during mastitis. miRNA analysis identified 45 miRNAs that commonly targeted multiple hub genes. Notably, bta‑miR‑21‑3p targets EGFR and IL1B and is involved in regulation of the PI3K/AKT/NF‑κB signaling pathway, suggesting a role in amplifying inflammatory responses. bta‑miR‑145 may contribute to balancing inflammation and tissue repair by regulating IL1B expression and inhibiting proliferation of mammary epithelial (Mac‑T) cells. Furthermore, bta‑miR‑138 appears to modulate antiviral and inflammatory responses through inhibition of the p65/NF‑κB pathway and regulation of PARP12 and EGFR. Overall, these results indicate that miRNAs act as coordinated regulators of inflammatory and metabolic pathways during mastitis. Conclusion Bovine mastitis is a complex, multifactorial condition driven by dynamic interactions among genes, miRNAs, and interconnected molecular pathways. By integrating differential expression analysis with network‑based and miRNA regulatory analyses, this study identified key molecular regulators involved in E. coli‑induced mastitis. The findings highlight the importance of immune‑related pathways, including JAK/STAT, interferon signaling, and NF‑κB, as well as EGFR‑associated metabolic and mitochondrial processes. These results provide a useful foundation for the development of molecular biomarkers, diagnostic tools, and breeding strategies aimed at improving mastitis resistance in dairy cattle.   کلمات کلیدی: پروفایل بیان ژنی, شبکه ژنی, میکرو‌آران‌ای, ورم پستان Keywords: Gene expression profiling, Gene network, microRNA, Mastitis. 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1587-3&slc_lang=fa&sid=1 Azadeh Azadeh Torabi آزاده ترابی Azadehtorabi@gmail.com 100319475328460026419 100319475328460026419 No Animal science research institute of Iran (ASRI), Agricultural Research, Education, and Extension Organization (AREEO) موسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی Zahra Roudbari زهرا رودباری roudbari.zahra@ujiroft.ac.ir 100319475328460026420 100319475328460026420 Yes University of Jiroft دانشگاه جیرفت