Research on Animal Production

fa تأثیر تزریق داخل تخم‌مرغی دی-لیمونن بر ریخت‌شناسی بافت‌های گوارشی و ایمنی در جنین جوجه‌های گوشتی The Effect of In Ovo Injection of D-Limonene on the Morphology of Digestive and Immune Tissues in Broiler Chicken Embryos فیزیولوژی فیزیولوژی پژوهشي Research مقدمه و هدف: صنعت طیور در سراسر جهان به دنبال جایگزین‌های طبیعی، ایمن و موثر برای آنتی‌بیوتیک‌های محرک رشد است که به دلیل نگرانی‌های مربوط به مقاومت باکتریایی و باقی‌مانده‌های دارویی، با محدودیت‌های شدیدی مواجه شده‌اند. در این راستا، ترکیبات گیاهی و مشتقات آن‌ها به دلیل دارا بودن خواص بیولوژیک متعدد، سمیت پایین و قابلیت تجزیه‌پذیری زیستی، مورد توجه ویژه قرار گرفته‌اند. دی-لیمونن، یک مونوترپن حلقوی طبیعی که به وفور در اسانس مرکبات یافت می‌شود، به خاطر خواص آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی، ضدمیکروبی و به‌ویژه توانایی منحصر به فردش در مهار آنزیم آروماتاز (آنزیم کلیدی در تبدیل آندروژن‌ها به استروژن‌ها) شناخته شده است. از سوی دیگر، فناوری تزریق داخل تخم‌مرغی (in ovo) یک روش نوین برای مداخله در مراحل حساس رشد جنینی و ارائه مستقیم ترکیبات زیست‌فعال است. این مطالعه با هدف بررسی تأثیر تزریق داخل تخم‌مرغی دو سطح مختلف دی-لیمونن بر ریخت‌شناسی (هیستومورفومتری) اندام‌های گوارشی و ایمنی در جنین جوجه‌های گوشتی طراحی شد. فرضیه اصلی این بود که دی-لیمونن می‌تواند با مکانیسم‌های مختلف از جمله تعدیل هورمونی و محافظت آنتی‌اکسیدانی، رشد و تمایز این بافت‌ها را به صورت دوز-وابسته تحت تأثیر قرار دهد. مواد و روش‌ها: این پژوهش بر روی 160 عدد تخم مرغ نطفه‌دار و همگن از گله مادر تجاری گوشتی (راس 308) با میانگین وزن 65-68 گرم انجام شد. تخم‌مرغ‌ها به‌طور تصادفی در قالب یک طرح کاملاً تصادفی به چهار گروه تیماری 40 تایی تقسیم شدند: گروه کنترل (C) که هیچ گونه تزریقی دریافت نکرد، گروه شاهد (CW) که 1/0 میلی‌لیتر آب مقطر استریل تزریق شد، گروه DL1 که 1/0 میلی‌لیتر عصاره خالص دی-لیمونن تزریق شد و گروه DL2 که 2/0 میلی‌لیتر از همان عصاره دی-لیمونن دریافت کرد. تزریق در روز پنجم جوجه‌کشی و از طریق اتاقک هوایی با رعایت کامل شرایط استریل انجام پذیرفت. در روز هجدهم انکوباسیون، نمونه‌های بافتی از اندام‌های گوارشی شامل مری، پیش‌معده، سنگدان، روده کوچک (ژژنوم) و کبد، و همچنین اندام‌های ایمنی اولیه شامل بورس فابرسیوس، طحال و تیموس جمع‌آوری شدند. نمونه‌ها پس از تثبیت شدن در فرمالین بافری 10 درصد، مراحل استاندارد آب‌گیری، شفاف‌سازی و قالب‌گیری در پارافین را طی کردند و مقاطع بافتی به ضخامت پنج تا هفت میکرومتر تهیه و با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ‌آمیزی شدند. بررسی هیستومورفومتریک با استفاده از میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین دیجیتال و نرم‌افزار تحلیل تصویر انجام شد و پارامترهایی از جمله ضخامت اپیتلیوم، ضخامت لایه ماهیچه ای، ارتفاع پرزهای روده، قطر غدد، ابعاد هپاتوسیت‌ها و ابعاد ساختارهای لنفاوی در اندام‌های ایمنی به دقت اندازه‌گیری شد. داده‌ها پس از اطمینان از نرمال بودن توزیع با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk، با آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و در صورت معنی‌دار بودن، مقایسه میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح معنی‌داری 05/0>P تجزیه و تحلیل شدند. نتایج: یافته‌های این پژوهش تغییرات معنی‌دار و دوز-وابسته‌ای را در پاسخ به تزریق دی-لیمونن نشان داد. در دستگاه گوارش، دوز بالای دی-لیمونن (DL2) باعث کاهش معنی‌دار ضخامت لایه عضلانی مری و پیش‌معده شد، اما در عین حال قطر غدد ترشحی در این اندام‌ها به طور چشمگیری افزایش یافت. در سنگدان، دوز پایین (DL1) موجب افزایش معنی‌دار ضخامت لایه عضلانی شد، در حالی که دوز بالا (DL2) منجر به افزایش عمق غدد مخاطی شد. در روده کوچک (ژژنوم)، تزریق دی-لیمونن در هر دو دوز باعث افزایش معنی‌دار ضخامت اپیتلیوم، ارتفاع پرزها و ضخامت لایه عضلانی شد که افزایش ارتفاع پرزها نشان‌دهنده پتانسیل قوی برای بهبود سطح جذب مواد مغذی است. در کبد، قطر هپاتوسیت‌ها و هسته آن‌ها در گروه‌های درمان شده با دی-لیمونن به طور معنی‌داری افزایش یافت، که حاکی از هایپرتروفی سلول‌های کبدی است. در سیستم ایمنی، نتایج حتی قابل توجه‌تر بود. دوز بالای دی-لیمونن (DL2) باعث افزایش معنی‌دار قطر گرههای لنفاوی در بورس فابرسیوس، قطر پولپ سفید طحال (مناطق تولید لنفوسیت) و ضخامت مرکز لبول‌های تیموسی شد. این نتایج به وضوح نشان می‌دهد که دی-لیمونن نه تنها بر بافت‌های گوارشی، بلکه بر گسترش و بلوغ اولیه سیستم ایمنی نیز تأثیر می‌گذارد. این پژوهش به طور قانع‌کننده‌ای اثبات کرد که تزریق داخل تخم‌مرغی دی-لیمونن در روز پنجم جوجه کشی یک راهبرد مؤثر برای تعدیل رشد و توسعه بافت‌های گوارشی و ایمنی در جنین جوجه گوشتی است. اثرات مشاهده‌شده که عمدتاً وابسته به دوز بودند، از طریق مکانیسم‌های چندگانه و به هم پیوسته‌ای شامل مهار آروماتاز، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و تحریک ترشح اعمال می‌شوند. به طور خلاصه، دوز پایین دی-لیمونن بیشتر برای تقویت ساختارهای عضلانی دستگاه گوارش و بهبود پتانسیل جذبی روده سودمند است، در حالی که دوز بالاتر پتانسیل بیشتری در تقویت قابلیت‌های تراوش و به‌ویژه، تقویت و توسعه سیستم ایمنی اولیه دارد. این یافته‌ها پایه علمی محکمی برای در نظر گرفتن دی-لیمونن به عنوان یک محرک رشد طبیعی و تعدیل‌کننده ایمنی در برنامه‌های پرورش طیور، به‌ویژه از طریق فناوری نوین تزریق داخل تخم‌مرغی، فراهم می‌کند. با این حال، برای کاربردی‌سازی این یافته‌های آزمایشگاهی در صنعت، لازم است مطالعات بیشتری صورت گیرد تا تأثیر مداخله‌ی مذکور بر عملکرد رشد، ضریب تبدیل غذایی، سلامت عمومی و نیز پاسخ جوجه‌ها به چالش‌های ایمنی در دوره پس از تولد ارزیابی شود. همچنین درک دقیق‌تر مکانیسم‌های مولکولیِ زمینه‌ساز این اثرات ضروری است. Introduction and Objective: The global poultry industry is actively seeking natural, safe, and effective alternatives to growth-promoting antibiotics, which have faced severe restrictions due to concerns about bacterial resistance and drug residues. In this context, phytogenic compounds and their derivatives have garnered significant attention due to their multiple biological properties, low toxicity, and biodegradability. D-limonene, a natural cyclic monoterpene abundantly found in citrus essential oils, is known for its antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial properties, and particularly its unique ability to inhibit the aromatase enzyme (the key enzyme in the conversion of androgens to estrogens). Furthermore, in ovo injection technology is a novel method for intervening during critical embryonic developmental stages and directly delivering bioactive compounds. This study was designed to investigate the effect of in ovo injection of two different levels of D-limonene on the morphology (histomorphometry) of the digestive and immune organs in broiler chicken embryos. The primary hypothesis was that D-limonene could dose-dependently influence the growth and differentiation of these tissues through various mechanisms, including hormonal modulation and antioxidant protection. Materials and Methods: This research was conducted on 160 fertile, homogeneous broiler breeder eggs (Ross 308) with an average weight of 65-68 grams. The eggs were randomly assigned in a completely randomized design into four treatment groups of 40 eggs each: Control group (C) receiving no injection, Sham group (CW) injected with 0.1 mL of sterile distilled water, DL1 group injected with 0.1 mL of pure D-limonene extract, and DL2 group injected with 0.2 mL of the same D-limonene extract. Injection was performed on the fifth day of incubation via the air cell under fully sterile conditions. On the eighteenth day of incubation, tissue samples were collected from the digestive organs, including the esophagus, proventriculus, gizzard, small intestine (jejunum), and liver, as well as the primary immune organs, including the bursa of Fabricius, spleen, and thymus. After fixation in 10% buffered formalin, the samples underwent standard processing steps of dehydration, clearing, and paraffin embedding. Tissue sections of 5-7 micrometers thickness were prepared and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). Histomorphometric examination was performed using a light microscope equipped with a digital camera and image analysis software. Numerous parameters, including epithelial thickness, muscular layer thickness, intestinal villus height, gland diameter, hepatocyte dimensions, and the dimensions of lymphoid structures in immune organs, were accurately measured. Data were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) after ensuring normal distribution with the Shapiro-Wilk test; if significant, means were compared using Duncan's multiple range test at a significance level of P < 0.05. Results: The findings of this research revealed significant and dose-dependent changes in response to D-limonene injection. In the digestive system, the high dose of D-limonene (DL2) caused a significant decrease in the thickness of the muscular layer in the esophagus and proventriculus, while simultaneously significantly increasing the diameter of the secretory glands in these organs. In the gizzard, the low dose (DL1) significantly increased the thickness of the muscular layer, whereas the high dose (DL2) led to an increase in the depth of the mucosal glands. In the small intestine (jejunum), D-limonene injection at both doses caused a significant increase in epithelial thickness, villus height, and muscular layer thickness; the increased villus height indicates a strong potential for improving the surface area for nutrient absorption. In the liver, the diameter of hepatocytes and their nuclei significantly increased in the D-limonene treated groups, suggesting hypertrophy of liver cells. In the immune system, the results were even more notable. The high dose of D-limonene (DL2) caused a significant increase in the diameter of the lymphoid nodules in the bursa of Fabricius, the diameter of the spleen's white pulp (lymphocyte-producing areas), and the thickness of the thymic lobules' medulla. These results clearly demonstrate that D-limonene affects not only the digestive tissues but also the development and early maturation of the immune system. This study convincingly demonstrated that in ovo injection of D-limonene on the fifth day of incubation is an effective strategy for modulating the growth and development of digestive and immune tissues in broiler chicken embryos. The observed effects, which were predominantly dose-dependent, are exerted through multiple interconnected mechanisms, including aromatase inhibition, antioxidant activity, and stimulation of secretion. In summary, the low dose of D-limonene is more beneficial for strengthening the muscular structures of the digestive tract and improving the intestinal absorptive potential, while the higher dose has greater potential for enhancing secretory capabilities and, particularly, strengthening and developing the primary immune system. Conclusion: These findings provide a solid scientific basis for considering D-limonene as a natural growth promoter and immune modulator in poultry breeding programs, especially through the novel technology of in ovo injection. However, to translate these laboratory findings into practical applications at the industrial level, further studies are essential to evaluate the impact of this intervention on growth performance, feed conversion ratio, general health, and response to immune challenges during the post-hatch period, as well as to gain a deeper understanding of the underlying molecular mechanisms of these effects.   تزریق داخل تخم‌مرغی, جنین, جوجه گوشتی, دستگاه گوارش, دی-لیمونن, سیستم ایمنی, هیستومورفومتری. Broiler chicken, D-limonene, Digestive system, Embryo, Histomorphometry, Immune syste, In ovo injection, 0 0 http://rap.sanru.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-96-9&slc_lang=fa&sid=1 Ali Kalantari Hesari علی کلانتری حصاری a.kalantarihesari@basu.ac.ir 100319475328460026400 100319475328460026400 No Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Science, Bu-Ali Sina University, Hamedan, Iran. گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران Bahman Navidshad بهمن نویدشاد bnavidshad@guilan.ac.ir 100319475328460026401 100319475328460026401 Yes Department of Animal Science, University of Guilan, Rasht, Iran گروه علوم دامی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران Hussein Ali Huossein حسین علی حسین hussein20280li@gmail.com 100319475328460026402 100319475328460026402 No Department of Animal Science, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran گروه علوم دامی، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران. Zeinab Hazbavi زینب حزباوی Z.habavi@uma.ac.ir 100319475328460026403 100319475328460026403 No Department of Range and Watershed Management, University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran گروه مدیریت مرتع و آبخیزداری، دانشگاه محقق اردبیلی، اردبیل، ایران. Maryam Royan مریم رویان m_royan2002@yahoo.com 100319475328460026404 100319475328460026404 No North Region Branch, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Rasht, IRAN پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، شعبه منطقه شمال، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، رشت، ایران